生物化學 第十三章 DNA的生物合成

第十三章DNA的生物合成DNA復制的基本規(guī)律DNA復制的酶學DNA復制的一般過程逆轉(zhuǎn)錄和其他復制方式DNA損傷與修復是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復制親代DNA子代DNADNA復制(DNAreplication)1DNA復制的基本規(guī)律半保留復制是DNA復制的基本特征雙向復制復制具有半不連續(xù)性DNA合成起始時需要引物復制具有高保真性1.1半保留復制WatsonandCrick:

"Ithasnotescapedournoticethatthespecific(base)pairingwehavepostulatedimmediatelysuggestsapossiblecopyingmechanismforthegeneticmaterial.”“我們提出的特定配對方式，讓人馬上聯(lián)想到遺傳物質(zhì)可能采用的復制機制，這一點我們并沒有忽略”TheReplicationofDNAinEscherichiacoli.MatthewMeselson&FranklinStahl

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA.1958,44:671-682平衡密度梯度離心15generations14000g×20hDNAwith14N1.708g/cm3DNAwith15N1.722g/cm3.asolutionof6.6molarCsCl:1.700g/cm3.MatthewMeselson&FranklinStahl

TheReplicationofDNAinEscherichiacoli.

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA.1958,44:671-682

DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制的概念1.2雙向復制原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。證明雙向復制的同位素標記試驗證明雙向復制的同位素標記試驗復制子(replicon)：從一個復制起始點開始的DNA復制區(qū)域。真核染色體DNA復制時有多個復制起始點，形成多個復制子(領(lǐng)頭鏈）leadingstrand--continuous

（滯后鏈）laggingstrand...discontinuous

1.3半不連續(xù)復制順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為隨從鏈。復制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性。

DNA新鏈的合成從5'to3'引物（Primer）：一段與模板鏈互補的短的核酸序列,通常是RNA，其作用在于提供一個自由的3′-OH與新?lián)饺氲拿撗鹾塑杖姿岬?’磷酸基團反應(yīng)生成新的磷酸二酯鍵。1.4DNA復制起始時需要引物Nucleotidesareaddedatthe3'-endofthestrand噬菌體T4噬菌體T7大腸桿菌酵母淋巴母細胞果蠅1.5復制具有高保真性復制高保真性的原因：遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；復制出錯時有即時的校讀功能；DNA損傷修復機制；復制終止時RNA引物的切除及填補。Erroneousrate:

10-8to10-10perbasepairperroundofreplication2DNA復制的酶學和拓撲學變化

DNA復制需要多種物質(zhì)：底物：dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3’-OH依賴DNA的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase,簡寫為DNA-pol或DDDP)其他酶和蛋白質(zhì)因子2.1核苷酸與核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復制的基本化學反應(yīng)2.2DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合DNA聚合酶的一般特征：需要引物需要模板以四種dNTP為底物5’到3’聚合活性（合成的新鏈與模板鏈反向互補）2.2.1DNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)1958年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornberg酶。5′

AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。辨認錯配的堿基對，并將其水解。該活性為即時校讀（proofreading)功能所必需

DNA-polⅠ還具有核酸外切酶活性DNA-polⅠ的主要功能：去除引物，填補引物消除后的空隙；對復制中的錯誤進行校讀，填補修復中出現(xiàn)的空隙。DNA聚合酶I的應(yīng)用：缺口平移（nicktranslation）標記探針蛋白酶處理后,DNA-polⅠ分裂成兩個片段，大片段通常稱為Klenow片段，也具有DNA聚合酶活性和3’5’外切活性,是實驗室常用的工具酶2.2.2DNA聚合酶Ⅱ1970年發(fā)現(xiàn)活性只有DNA-polⅠ的5%此酶缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復中該酶起到一定的作用。

2.2.3DNA聚合酶III全酶

（polymeraseIIIholoenzyme）2.2.3DNA聚合酶III全酶

1959NobelPrizewinnerinphysiologyormedicine.(jointlywithSeveroOchoa)"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid."ArthurKornberg1918～2007“在老孔伯格獲獎十年之后，人們才知道，他所發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶并非細菌真正用于復制DNA的酶，在細胞內(nèi)執(zhí)行這個任務(wù)的是另一種新發(fā)現(xiàn)的酶——DNA聚合酶III。老孔伯格的酶（被命名為DNA聚合酶I）只是在DNA復制中起修補作用（不過，這種酶后來在分子生物學研究和遺傳工程中發(fā)揮了巨大的作用）。值得老孔伯格欣慰的是，新的酶是他的二兒子托馬斯·孔伯格在哥倫比亞大學讀書時發(fā)現(xiàn)的。托馬斯現(xiàn)在是加州大學舊金山分校的生物化學教授?！保ǚ街圩硬┛停荷详嚫缸颖┻@一家人共發(fā)現(xiàn)了30多種酶。老孔伯格1975年寫了一本書“Fortheloveofenzymes”（酶的情人）他的大兒子：RogerKornbergwon2006NobelPrizeinChemistryforhisworkingeneticresearch.2.2.4真核生物的DNA聚合酶統(tǒng)一采用希臘字母命名DNA-polα：合成引物DNA-polγ：線粒體內(nèi)DNA-polδ：負責后續(xù)鏈的合成DNA-polβ：修復核內(nèi)DNADNA-polε：負責前導鏈的合成……ThumbFingersPalmDNApolymerasehasaDNA-bindingcleft（裂縫）createdbythreesubdomains.解鏈過程中正超螺旋的形成2.3復制中的解鏈伴有DNA分子拓撲學變化DNA拓撲異構(gòu)酶類型底物例子IA型單鏈DNA大腸桿菌拓撲酶I和III，酵母和人類拓撲酶III，古細菌反向促旋酶IB型單鏈DNA真核生物拓撲酶III型雙鏈DNA大腸桿菌拓撲酶II（DNA促旋酶）和IV；真核生物拓撲酶IVI型拓撲異構(gòu)酶（TypeItopoisomerase

）

切斷DNA單鏈后再重新連接，不需ATP。II型拓撲異構(gòu)酶（TypeIItopoisomerase

）切斷DNA雙鏈后再重新連接，需ATP

DNA拓撲異構(gòu)酶2.4解螺旋酶解開DNA雙鏈使成單鏈解螺旋酶(Helicase）即DnaB，又稱rep蛋白與復制相關(guān)的基因定名為dnaA,dnaB,dnaC……dnaX。相應(yīng)的蛋白質(zhì)命名為DnaA,DnaB,……DnaX等。2.5單鏈DNA結(jié)合蛋白

(Single-strandDNA-bindingprotein，SSB)2.6引物合成酶(Primase)由大腸桿菌的dnaG基因編碼的引物酶(primase)催化引物RNA分子的合成。2.7DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接酶的特點：要求一條DNA鏈有3’自由羥基而另一條鏈的5’端有磷酸基團；只能連接雙鏈DNA或DNA-RNA雜交雙鏈中的單鏈缺口，但不適于雙鏈RNA鏈中的單鏈缺口，也不適于單鏈DNA或RNA間的連接。名稱功能DNA聚合酶聚合脫氧核苷酸拓撲異構(gòu)酶理順DNA鏈解螺旋酶(DnaB蛋白，rep蛋白)解開DNA雙鏈引物酶(DnaG蛋白)催化RNA引物生成單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）穩(wěn)定解開的單鏈DNA連接酶連接岡崎片段參與復制的各種酶和蛋白質(zhì)3DNA生物合成過程三個階段:起始(Initiation）延伸（Elongation）終止（Termination）參與復制起始的各種蛋白質(zhì)名稱功能DnaA蛋白辨認起始點解螺旋酶(DnaB蛋白，rep蛋白)解開DNA雙鏈DnaC蛋白協(xié)助解螺旋酶引物酶(DnaG蛋白)催化RNA引物生成單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）穩(wěn)定解開的單鏈拓撲異構(gòu)酶理順DNA鏈DNA復制起點雙鏈解開；引發(fā)體(primosome)的生成；RNA引物的生成；DNA聚合酶將第一個脫氧核苷酸加到引物RNA的3’-OH末端。3.1起始階段E.coli復制起始點oriC

GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

11317293244

···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復序列

反向重復序列5

3

5

3

5’3’3’5’反向重復序列（revertedrepeatsequence)反向重復序列可自身互補，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)大腸桿菌復制起始模型

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

3.3終止

(Termination)：

切除引物、填補空缺和連接缺口32ter82oriC3H-thymidine大腸桿菌的θ型復制岡崎片段的連接

(JoiningofOkazakifragments)5’5’3’3’復制起始點3’5’3’5’5’3’5’3’同一個復制子內(nèi)以及相鄰復制子中的子代DNA片段連接起來5’3’5’3’復制起始點5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’復制起始點復制起始點同一個復制子內(nèi)及相鄰復制子中的子代DNA片段連接起來哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM3.4.真核生物的DNA生物合成

?細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關(guān)鍵點。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調(diào)控作用。起始、延伸和終止三個階段多個復制子，復制起始點富含AT堿基復制中多種蛋白的作用類似原核DNA復制所需蛋白，但機制更為復雜復制過程涉及核小體的解體和重新生成，后續(xù)鏈中岡崎片段的長度就是一個核小體所含的DNA片段長度真核生物DNA復制概況真核生物DNA復制所需多種蛋白的功能與原核類似

Pol

（或Pol

） 填補岡崎片段之間的空隙DNA連接酶Ⅰ封閉缺口RPA 穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA

解旋酶復制叉的形成和移動必不可少拓撲異構(gòu)酶 釋放復制叉前進時產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力真核生物復制過程中的酶及功能線性DNA分子如何避免每復制一次末端就縮短一次？末端DNA如何復制?將線狀DNA復制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚體線性分子。e.g.T4phage末端產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)每條DNA鏈的5’末端都共價結(jié)合著一個末端蛋白。e.g.adenovirusDNA端粒酶負責染色體末端復制，染色體的末端長度在適當范圍內(nèi)可變TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2009真核生物的端粒和端粒酶端粒(telomere)：真核生物染色體線性DNA末端結(jié)構(gòu)，含DNA串聯(lián)重復序列，與染色體的穩(wěn)定有關(guān)。TheGreekword“telos”means“end”.端粒“端粒之于染色體，好像鞋帶兩頭兒的小塑料套和一根美麗鞋帶的關(guān)系。如果沒有小塑料套，由幾股繩編起來的鞋帶兒就要散架（下圖）；同理，如果沒有端粒，你的染色體就劈叉兒、磨禿。你說這么重要的東西值不值一個諾貝爾獎？”--------摘自“端粒，好好看住別丟了！”（/archives/21095.html）科學松鼠會：/

端粒酶(telomerase)：RNA-蛋白質(zhì)復合物，所含RNA與端粒的堿基序列部分互補。有反轉(zhuǎn)錄酶活性，防止復制時端粒的縮短。組成：

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)

端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTRorhTERC)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶作用機制端粒酶作用機制在高等真核生物，端粒酶只在胚胎細胞及需要頻繁增殖的細胞（比如免疫細胞）中有活性，而成年組織細胞中沒有活性或活性極低。大約90%的腫瘤類型發(fā)現(xiàn)有端粒酶活性端粒酶與細胞的永生性（immortalization）及腫瘤發(fā)生（tumorogenesis）都密切相關(guān)。應(yīng)用：針對端粒酶的腫瘤治療，抗衰老4.1逆轉(zhuǎn)錄

(ReverseTranscription)逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板生成DNA的過程逆轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶活性RNAdependent（依賴于RNA的）DNAdependent（依賴于DNA的）RNA酶H活性（RNaseHactivity）：水解DNA-RNA雜化雙鏈中的RNA

逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

"fortheirdiscoveriesconcerningtheinteractionbetweentumourvirusesandthegeneticmaterialofthecell"HowardMartinTeminDecember10,1934～February9,1994NobelPrizeinPhysiologyorMedicine1975DavidBaltimore

Mar7,1938～RenatoDulbecco

February22,1914～試管內(nèi)合成cDNAcDNA(complementaryDNA)：以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。

分子生物學研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環(huán)復制5'

5

3

3

5

5

5

5

3

3

3

3

5'dNTPDNA-polγ

D環(huán)復制(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復制形式。

小結(jié)DNA復制的特點：半保留式，半不連續(xù)性，方向性雙向復制，復制叉，復制泡DNA的復制過程中多種酶與蛋白因子的作用了解DNA復制過程：起始、延伸、終止重要概念：半保留復制、復制子，岡崎片段，端粒酶，逆轉(zhuǎn)錄DNA損傷（突變）與修復DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

突變(mutation):可以通過復制而遺傳的DNA結(jié)構(gòu)的任何永久性改變,也稱為DNA損傷(DNAdamage)一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)

二、引發(fā)突變的因素物理因素

紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV化學因素短期檢測方法化學誘變劑的細菌檢測法(Ames)試驗細胞遺傳學檢測法致畸試驗Ames試驗：實驗組：his-菌株，不含his的培養(yǎng)基，待檢物陰性對照組：his-菌株，不含his的培養(yǎng)基，不含待檢物“三致因子”(致突變、致畸、致癌)的檢出三、突變的分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的堿基錯配稱點突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯配鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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glu

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·

C肽鏈CTCGAG基因G甲基化引起的點突變（二）缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。缺失或插入都可導致框移突變

。缺失引起的移框突變5’……GCA

GUA

CAU

GUC……3’

丙纈組纈…..缺失：GAG

UAC

AUG

UC……

谷酪蛋絲….框移突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。

（三）重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。

由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型四、DNA損傷的修復修復(repairing)是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其回復為原有的天然狀態(tài)。光修復(lightrepairing)切除修復(excisionrepairing)重組修復(recombinationrepairing)SOS修復

修復的主要類型（一）光修復光修復酶(photolyase)

UVUvrAUvrB