木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

DB32/TXXXX—2019木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程范圍本標準規(guī)定了木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)中所涉及的生產(chǎn)場地要求、生產(chǎn)流程、產(chǎn)品檢測、建立生產(chǎn)檔案、包裝及貯存運輸要求等技術(shù)環(huán)節(jié)。本標準適用于木霉固態(tài)菌種的生產(chǎn)。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運圖示標志GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標準GB3838地表水環(huán)境質(zhì)量標準GB20287農(nóng)用微生物菌劑NY/T883農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。固態(tài)菌種solidspawn生長在固態(tài)培養(yǎng)基料上的菌種。微生物接種劑microbialinoculant一種或一種以上的目的微生物經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)增殖后直接使用，或經(jīng)濃縮或經(jīng)載體吸附而成的活菌制品。固體培養(yǎng)基solidmedium以富含木質(zhì)纖維素或淀粉類天然物質(zhì)為主要原料，添加適量的有機氮源及無機鹽類，具一定水分含量的培養(yǎng)基。生產(chǎn)場地要求生產(chǎn)基地選擇生產(chǎn)基地應(yīng)遠離居住區(qū)、城區(qū)等，并且交通便利，生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，周邊植被覆蓋率高。生產(chǎn)地塊集中連片并位于原料收集區(qū)較近的地方。車間保溫保濕性能良好，同時具備通風(fēng)性能。生產(chǎn)環(huán)境廠區(qū)空氣質(zhì)量達到大氣環(huán)境質(zhì)量標準GB3095中II類標準要求。發(fā)酵用水達到地表水質(zhì)量標準GB3838中III類水質(zhì)要求，冷卻水及其他用水應(yīng)達到標準IV類水質(zhì)要求。生產(chǎn)車間原料庫原料庫要求水電方便，平坦干燥、通風(fēng)良好，光照充足、空曠寬闊，遠離火源，注意防火設(shè)施的建設(shè)。接種室接種室必須設(shè)緩沖間，通風(fēng)和保溫性能良好，并具有防塵換氣性能，墻內(nèi)壁和屋頂光滑，必須做好殺菌消毒工作，確保接種室環(huán)境的相對無菌。培養(yǎng)室培養(yǎng)室內(nèi)壁和屋頂光滑，便于清洗與消毒，有條件的單位可以建設(shè)半地下室的培養(yǎng)室，或者將培養(yǎng)室墻壁加厚，有利于培養(yǎng)室的控溫。檢驗室檢驗室宜留出便于檢驗儀器設(shè)備安裝的場所，同時水電布局要求合理，建立車間環(huán)境衛(wèi)生制度，定期對生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的。生產(chǎn)流程技術(shù)環(huán)節(jié)木霉固態(tài)菌種主要包括木霉高密度液體發(fā)酵、固體基質(zhì)準備、接種木霉液體菌種、固體發(fā)酵的控制、固態(tài)菌種后處理、產(chǎn)品包裝、質(zhì)量檢測及出廠等技術(shù)環(huán)節(jié)。具體工藝流程見附錄A。菌種要求原種原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對原種有如下要求：——原種應(yīng)有菌種鑒定報告。——原種應(yīng)有菌種的企業(yè)編號、來源信息等。菌種保管采用固體曲保藏和凍干管保藏的方法保藏木霉固體孢子，確保無雜菌污染，菌種不退化。分類純化并定期檢查，建立菌種檔案。菌種質(zhì)量控制在進行生產(chǎn)之前，應(yīng)對所使用的菌種進行檢查，并確認其純度和性能沒有發(fā)生退化，如出現(xiàn)污染或者退化情況，該菌種不能作為生產(chǎn)用菌種，應(yīng)該按照標準NY/T883執(zhí)行。液體發(fā)酵增殖木霉菌種的液體發(fā)酵增殖，按照NY/T883執(zhí)行。具體的培養(yǎng)基見附錄B。木霉菌絲體采用棉蘭染色法觀察：在載玻片中央滴加一滴無菌水，并將菌絲體均勻分布其中，蓋上蓋玻片，盡量不留氣泡，從一側(cè)滴加少量的棉蘭染色液染色5min，染色結(jié)束后用無菌水慢慢沖洗染色液，表面風(fēng)干后在顯微鏡下觀察，染色液配方具體見附錄C。菌絲清晰可見，生長良好，沒有出現(xiàn)雜菌污染，可以作為菌種繼續(xù)使用；如果菌絲細小并呈不規(guī)則分布或者有雜菌污染，應(yīng)按標準NY/T883處理。固體培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基要求發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后木霉菌絲體生長旺盛，在保證有一定的生物量（菌絲體）的前提下兼顧分生孢子及有效代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。原料要求來源充足、價格合理、營養(yǎng)成分充足，宜采用農(nóng)作物秸稈及農(nóng)用氨基酸作為主要原料。制備過程秸稈前處理以農(nóng)作物秸稈作為發(fā)酵基質(zhì)，使用前晾干（含水率約15%，含有機質(zhì)約65%）并用粉碎機將其粉碎成0.3cm～0.4cm長的片段。氨基酸添加往上述秸稈中添加氨基酸稀釋液，氨基酸稀釋液的添加量為每100g曬干后的秸稈加入100～200mL的氨基酸稀釋液（氨基酸原液總氨基酸含量≥10%），調(diào)節(jié)起始pH為3.0～4.0，物料的含水率應(yīng)該嚴格控制在50%～60%之間，陳化4h～6h后備用。滅菌高壓蒸汽滅菌要求固體發(fā)酵培養(yǎng)基物料滅菌溫度為121℃～130℃，滅菌時間為1.0h～2.0h；或者采用100℃滅菌2h～4h，24h后再滅菌一次。滅菌效果檢測將1g固體發(fā)酵產(chǎn)物加入到9mL無菌水中，充分混勻后制成懸液，吸取1mL懸液加入到裝有已滅菌的9mL營養(yǎng)肉湯的試管中，并做至少三個生物學(xué)重復(fù)，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，24h內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體后即可判定徹底滅菌，反之則判定為滅菌不徹底，不可用于固體發(fā)酵。接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基高溫蒸汽滅菌后，待其降至室溫，盡快將滅好菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至固體發(fā)酵培養(yǎng)室。將發(fā)酵好的木霉菌絲體按5%的接種量（v/w，鮮重）接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基料中并充分拌勻，分裝到不同的淺盤當中，并將塑料淺盤轉(zhuǎn)移到具有控溫控濕功能的發(fā)酵室內(nèi)進行培養(yǎng)。發(fā)酵控制培養(yǎng)溫度固體發(fā)酵的溫度應(yīng)該嚴格控制在（28±2）℃，根據(jù)不同木霉發(fā)酵特性和生長代謝特征，適當調(diào)整到最佳的發(fā)酵溫度。物料含水率固體發(fā)酵初期，最適宜的物料含水率應(yīng)該控制在50%～60%之間，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)品的含水率應(yīng)該控制在20%～40%之間。空氣濕度固體發(fā)酵過程中，空氣濕度宜嚴格控制在70%～75%之間。發(fā)酵終點判斷物理性狀采用感觀法評價固體發(fā)酵物料的顏色、形態(tài)和氣味。孢子定量稀釋涂布以無菌操作取樣25g轉(zhuǎn)至225mL無菌生理鹽水中，并充分震蕩后制成1：10的菌懸液。并利用梯度稀釋法進行樣品稀釋，吸取最后的稀釋液0.1mL于木霉選擇性培養(yǎng)基上（見附錄B），并用涂布棒將菌懸液涂布均勻。培養(yǎng)在28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2d～3d，注意觀察菌落的生長情況。計數(shù)——記錄各平板的菌落總數(shù)，求出不同稀釋度平板中的平均菌落數(shù)，計算出每克原始樣品中的菌落數(shù)?！腆w發(fā)酵產(chǎn)物中有效活菌數(shù)含量≥4.0×109個/克。產(chǎn)品檢測有效活菌數(shù)檢測按照5.7.2的方法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的有效活菌數(shù)。雜菌率檢測雜菌率的檢測按照GB20287執(zhí)行，木霉固體發(fā)酵產(chǎn)物的雜菌數(shù)應(yīng)≤1.0×104個/克。其他項目檢測固體發(fā)酵物的細度、有害元素含量（Hg、Pb、Cd、Cr、As）、pH（5.5～7.5）、大腸桿菌數(shù)、蛔蟲卵死亡率值達到NY/T883的要求。建立生產(chǎn)檔案每批次生產(chǎn)的產(chǎn)品，必須建立完善的生產(chǎn)檔案，包括產(chǎn)品檢驗項目、檢驗結(jié)果、實驗人、批準人以及檢驗日期等準確信息。包裝及貯存運輸要求包裝包裝標簽按GB/T191規(guī)定執(zhí)行。貯存產(chǎn)品應(yīng)貯存于陰涼干燥處，環(huán)境溫度不宜超過30℃，并避免與化肥、農(nóng)藥等一同貯存。運輸在運輸過程中應(yīng)注意防潮、防曬、防破裂。

（規(guī)范性附錄）

木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程示意圖

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基及其配方原種培養(yǎng)基及其配方：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），其中馬鈴薯200g煮沸后取濾液，葡萄糖20g，瓊脂25g，水1000mL，pH調(diào)整為5.0。搖瓶種子培養(yǎng)基及其配方：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，其中馬鈴薯200g煮沸后取濾液，葡萄糖20g，水1000mL，pH調(diào)整為5.0。液體發(fā)酵培養(yǎng)基及其配方：土豆150kg/T、蔗糖15kg/T、玉米粉5g/T、(NH4)2SO45kg/T、MgSO4·7H2O0.5kg/T、KH2PO41kg/T、pH自然；pH調(diào)整為5.0。固體發(fā)酵培養(yǎng)基：農(nóng)作物秸稈（優(yōu)選水稻秸稈和玉米秸稈，含水率約15%，含有機質(zhì)量約65%）晾干后用粉碎機將其粉碎成0.3cm～0.4cm長的片段；往上述秸稈中添加氨基酸稀釋液，氨基酸稀釋液的添加量為每100g曬干后的秸稈加入100mL～200mL的氨基酸稀釋液（相當于100g曬干后的秸稈中加入10mL～20mL的氨基酸水解液原液，氨基酸原液中總氨基酸的含量≥10%），調(diào)節(jié)起始pH為3.0～4.0，初始含水率嚴格控制在50%～60%之間，陳化4h～6h后備用（可以對秸稈進行預(yù)處理，更利于木霉利用秸稈）。木霉選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，硫酸鎂0.5g/L，瓊脂20.0g/L，孟加拉紅0.033g/L；上述培養(yǎng)基使用前，加入氯霉素0.1g/L，五氯硝基苯（75%可濕性粉劑）0.2g/L，