蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定

關(guān)于蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定§8-1概述§8-2蛋白質(zhì)的定性測(cè)定（自學(xué)）§8-3蛋白質(zhì)的定量測(cè)定*（§8-4蛋白質(zhì)的末端測(cè)定）§8-5氨基酸的定性測(cè)定（自學(xué)）§8-6氨基酸的定量測(cè)定*§8-7氨基酸的分離及測(cè)定第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定第2頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天本章重點(diǎn)凱氏定氮法的原理及注意事項(xiàng)。蛋白質(zhì)快速測(cè)定法有哪些？氨基酸總量的測(cè)定方法（甲醛滴定法）。第3頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第一節(jié)概述

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物。蛋白質(zhì)換算系數(shù)F

玉米、雞蛋、肉6.25花生5.46

乳制品6.38大米5.95

面粉5.70大豆及制品5.71蛋白質(zhì)平均含N量（15-17.6）為16%

。第4頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同的食品中蛋白質(zhì)含量不一樣，一般動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。雞肉鴨兔肉牛肉豬肉帶魚(yú)

21.516.521.220.19.518.1大豆稻米菠菜蘋(píng)果黃瓜牛乳

36.38.52.40.40.83.5第5頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定意義：評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。為合理開(kāi)發(fā)利用食物資源，提高產(chǎn)品質(zhì)量，優(yōu)化食品配方及生產(chǎn)過(guò)程控制提供依據(jù)。第6頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天其中：凱氏定氮法——最常用的，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用普遍。雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法等——多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。國(guó)外：紅外分析儀在一般的常規(guī)檢驗(yàn)中多進(jìn)行氨基酸總量的測(cè)定，通常采用酸堿滴定法來(lái)完成。各種氨基酸的分離與定量——色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法：分兩大類

一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量；

另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基（酸性和堿性基團(tuán)、芳香基團(tuán)等）測(cè)定蛋白質(zhì)含量。第7頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測(cè)定

（自學(xué)）一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書(shū)中列舉了5種染料。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色（3種方法）（二）脂蛋白的顯色（2種方法）第8頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天測(cè)定總氮量→

N%×F=粗蛋白質(zhì)含量%因?yàn)椋簶悠分谐鞍椎猓赡苓€包括有非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類脂、卟啉和含氮色素等。第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定！??！第9頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、 凱氏定氮法

由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。改良：氮的完全氨化，縮短時(shí)間，簡(jiǎn)化操作。主要改良催化劑及消化蒸餾裝置。第10頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（一）常量凱氏定氮法

原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。①用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl滴定或H2SO4溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。②也可以用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過(guò)量的酸。為什么？第11頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天催化劑煮沸1、消化：NCOC+濃H2SO4（NH4）2SO4+CO2+SO2+H2O

2、蒸餾與吸收：2NaOH+（NH4）2SO42NH3↑+Na2SO4+2H2O

2NH3+4H3BO3

（NH4）2B4O7+5H2O3、滴定：（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3(注:NCOC,Nitrogencontainingorganiccompounds)凱氏定氮法原理（方程式）整個(gè)過(guò)程分三步：消化、蒸餾與吸收、滴定第12頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.消化<1>加硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn)340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。要防止暴沸第13頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天<2>加硫酸銅作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑、蒸餾時(shí)堿性指示劑。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。<3>加氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。第14頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天凱氏定氮法注意事項(xiàng)圖：常量凱氏定氮消化及蒸餾裝置

a．消化裝置b．蒸餾吸收裝置1、硫酸鉀及硫酸銅的作用2、火候控制3、裝置的氣密性4、何時(shí)加堿5、難消化的對(duì)策6、停止蒸餾第15頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天自動(dòng)回流消化蒸餾儀第16頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.蒸餾與吸收

消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。“以奈氏試劑”檢查。同時(shí)用4%硼酸吸收〔Nessler試劑，K2（HgI4）〕檢驗(yàn)NH4+離子，析出黃色或紅棕色沉淀。第17頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.滴定用HCl滴定用混合指示劑（甲基紅+溴甲酚綠或亞甲基蘭+甲基紅）終點(diǎn)：藍(lán)色→微紅色計(jì)算：F要根據(jù)樣品來(lái)源定

3學(xué)時(shí)第18頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天說(shuō)明及注意：①本法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定（粗蛋白質(zhì)）。結(jié)果準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)。②所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。③同時(shí)作一空白試驗(yàn)，從消化開(kāi)始到滴定。④消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無(wú)硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。第19頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

⑤

消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪拢⒋龠M(jìn)其消化完全。

⑥樣品中若含脂肪或糖較多時(shí)，消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開(kāi)始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。⑦當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過(guò)氧化氫2—3m1后再繼續(xù)加熱消化。第20頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑧—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間（如大豆粉）。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。⑨蒸餾裝置不能漏氣。蒸餾時(shí)，加熱火力要穩(wěn)定，否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。(NH4)2SO4檢驗(yàn)第21頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑩蒸餾前加NaOH要足量，溶液應(yīng)變?yōu)樯钏{(lán)色或黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、銅氨離子），如顏色不變可能堿不夠

。⑾蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。⑿H3BO3吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40℃，否則對(duì)NH3的吸收作用減弱而造成損失。

第22頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）微量凱氏定氮法1、原理、步驟及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：樣品量、試劑用量減少加入硼酸量由50ml10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置見(jiàn)下圖。第23頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天保持酸性第24頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天改良式微量凱氏定氮裝置

第26頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（三）自動(dòng)凱氏定氮法

1、原理及適用范圍同前

2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。第27頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天如何測(cè)定蛋白氮？先把非蛋白質(zhì)的含氮物與蛋白質(zhì)分開(kāi)。一般多采用沉淀劑（CuSO4+NaOH，或三氯乙酸

），將蛋白質(zhì)沉淀析出，經(jīng)過(guò)過(guò)濾（或離心分離），將沉淀物再用凱氏法測(cè)定含N量。

馬鈴薯含非蛋白氮多。乳中非蛋白氮的測(cè)定？

第28頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染?？焖俜椒ǎ弘p縮脲法紫外分光光度法染料結(jié)合法水楊酸比色法紅外光譜法考馬斯亮藍(lán)染料比色法……

樣品消化轉(zhuǎn)化為銨鹽后，在一定條件下與水楊酸鈉和次氯酸鈉生成藍(lán)色化合物，660nm比色。

在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合染色，620nm吸收?？臁㈧`敏，干擾較少。第29頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.原理脲（尿素）NH2—CO—NH2

加熱至150~160℃時(shí)，兩分子縮合成雙縮脲。

雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡(luò)合物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵—CO—NH—，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)其吸光度，確定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2第30頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天配合物：雙縮脲銅鈉氫氧化物第31頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

注：測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化

可直接用粉樣，振蕩、顯色后離心。

2. 方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中常用。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。

3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)

4.試劑：

(1)堿性硫酸銅溶液

(2)四氯化碳第32頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天5．操作方法：采用凱氏法測(cè)出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。三．紫外吸收法1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，│R（—NH—CH—CO）

對(duì)紫外光有吸收作用，在280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。第33頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3．主要儀器：①紫外分光光度計(jì)②離心機(jī)（3000～5000r/min）4．操作：用凱氏法測(cè)得結(jié)果的同類樣品作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)牛乳

冰醋酸第34頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第五節(jié)氨基酸的定性測(cè)定（自學(xué)）利用各種顯色反應(yīng)（134～138頁(yè)）第35頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、氨基酸的一般顯色反應(yīng)茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經(jīng)典的常用顯色法，后一種是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光顯色法。1.茚三酮法氨基酸或蛋白質(zhì)能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物。2.吲哚醌法各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認(rèn)氨基酸。3.鄰苯二甲醛法（最靈敏）鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340nm和455nm。在手提式紫外燈(254/365)下觀察。

各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同。第36頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng)利用個(gè)別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應(yīng)定性氨基酸?？蓱?yīng)用于紙層析和紙電泳顯色。

精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和羥賴氨酸、羥脯氨酸,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸和組氨酸。第37頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第六節(jié)氨基酸定量測(cè)定

一．氨基酸的一般定量測(cè)定

（一）甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有堿性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與—NH2—結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來(lái)滴定—COOH基。（有多種寫(xiě)法）

第38頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、測(cè)定適量樣品于100ml容量瓶中（含氨基酸約20mg）→水定容→取20.0ml于燒杯中，加60ml水→用0.05mol/LNaOH滴至pH8.2（此體積可供計(jì)算總酸含量）→加10.0ml中性甲醛→NaOH滴至pH9.2，記錄消耗體積V1。空白試驗(yàn)：80ml水→NaOH調(diào)至pH8.2→加10.0ml中性甲醛→NaOH滴至pH9.2，耗V0ml。用酸度計(jì)電極的選擇？第39頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、說(shuō)明①本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測(cè)定。②固樣先粉碎，稱量后用水萃取約半小時(shí)（50℃水?。＂垆@鹽的存在使結(jié)果偏高，因其也與甲醛作用產(chǎn)生酸。④也可用指示劑指示終點(diǎn)（中性紅、百里酚酞），但準(zhǔn)確度稍差，對(duì)深色樣品要用活性炭脫色，但芳香族氨基酸易被吸附。第40頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天同時(shí)取兩份樣：①+中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質(zhì)。pH6.8～8.0②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。pH9.4～10.6(淡藍(lán)色)

二者之差可計(jì)算氨基酸含量。第41頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）茚三酮比色法1、原理：氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物（脯氨酸反應(yīng)成黃色），可用吸光光度法測(cè)定，λ=570nm。2、測(cè)定：樣品→水提取氨基酸，活性炭脫色（Δ），過(guò)濾→分取澄清液于25ml比色管中→加茚三酮，pH8.04磷酸鹽緩沖液→水浴加熱15min→迅速冷卻，水定容→靜置15min→測(cè)A570，空白為參比。同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，氨基酸標(biāo)液用某一干燥的氨基酸如異亮氨酸配制。3、結(jié)果：氨基酸含量（mg/100g）以所用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸計(jì)第42頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天二．個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定介紹了8種氨基酸的定量測(cè)定方法見(jiàn)P147～155第43頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第七節(jié)氨基酸的分離與測(cè)定

一．薄層色譜法（TLC法）ThinLayerChromatography簡(jiǎn)介：

一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開(kāi)，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來(lái)分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。第44頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）原理：

取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開(kāi)，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種氨基酸可達(dá)到彼此分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，鑒別氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。

第45頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月