南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)方法

DB32/TXXXX—2020南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了南美白對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）肝腸胞蟲（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymeraswchainreation，PCR）檢測(cè)方法的原理、試劑材料、儀器設(shè)備、操作步驟和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于南美白對(duì)蝦樣品中肝腸孢蟲帶蟲情況的高靈敏定性檢測(cè)。其他環(huán)境生物和餌料生物，以及非生物樣品中肝腸胞蟲帶蟲情況檢測(cè)可參照此方法。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T25878—2010對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）檢測(cè)PCR法SC/T7202.2—2007斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒診斷規(guī)程第2部分：PCR檢測(cè)法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1肝腸胞蟲Enterocytozoonhepatopenaei一種感染對(duì)蝦肝胰腺、腸道等器官的微孢子蟲，可致南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢，養(yǎng)殖產(chǎn)量嚴(yán)重下降。4技術(shù)原理南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)檢測(cè)方法是以樣品DNA為模板，針對(duì)其胞壁蛋白基因設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性巢式寡核苷酸序列為引物，在四種脫氧核糖苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶的合成作用，經(jīng)過先后兩步數(shù)十次變性、退火和延伸的反應(yīng)循環(huán)，使模板上介于兩對(duì)引物間的DNA片段得到特異性巢式擴(kuò)增，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段是否存在。5試劑材料5.1在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的化學(xué)試劑。5.2實(shí)驗(yàn)用水為無菌蒸餾水或超純水。5.3無水乙醇。5.4液體石蠟。5.5二氧化氯消毒劑。5.6電泳瓊脂糖。5.71kbDNAMarker。5.8Tris平衡酚。5.9TaqDNA聚合酶（5U/μL）。5.1010×PCR緩沖液，無Mg2+，隨TaqDNA聚合酶提供。5.11氯化鎂溶液（25mmol/L）。5.12dNTP（含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L的混合物）。5.1320mg/mL蛋白酶K。5.14TE緩沖液、抽提緩沖液、1×電泳緩沖液、6×載樣緩沖液。5.1510mol/L乙酸銨。5.16酚-三氯甲烷-異戊醇（25：24：1）。5.17核酸染料。5.1870%乙醇。5.19陽性對(duì)照為已知受EHP感染的南美白對(duì)蝦樣品；陰性對(duì)照為已知未受EHP感染的南美白對(duì)蝦樣品；空白對(duì)照為無菌雙蒸水。6儀器設(shè)備所需儀器設(shè)備按照SC/T7202.2—2007中第6章的規(guī)定。所有非一次性使用的器具應(yīng)經(jīng)清洗，浸于新配制的有效氯3.0×10-3的二氧化氯消毒劑中5min，經(jīng)無PCR產(chǎn)物污染的蒸餾水或超純水充分淋洗干凈后方可用于檢測(cè)。7操作步驟7.1樣品準(zhǔn)備取活體或冰凍南美白對(duì)蝦或其他生物樣品50mg～100mg（環(huán)境沉積物樣品約500mg），放入滅菌的1.5mL離心管中，避免樣品間交叉污染。7.2DNA的提取樣品DNA的提取參照SC/T7202.2—2007中7.1.3執(zhí)行。7.3PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備7.3.1巢式第一步PCR的反應(yīng)的模板為抽提的樣品DNA，其反應(yīng)預(yù)混物組成及反應(yīng)條件見表1。表1巢式第一步PCR反應(yīng)預(yù)混物組成及反應(yīng)條件試劑25μL體系（μL）50μL體系（μL）10×PCR緩沖液（無Mg2+）2.55MgCl(25mmol/L)24DNA模板0.51dNTP(10mmol/L)12100ng/μL引物F1：5’-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3’12100ng/μL引物R1：5’-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3’12TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.250.5滅菌雙蒸水16.7533.5擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃30s、58℃30s、68℃45s，30次循環(huán)；68℃終延伸5min。4℃保溫產(chǎn)物大?。?14bp7.3.2巢式第二步PCR的反應(yīng)模板為稀釋1000倍后的第一步PCR產(chǎn)物，反應(yīng)預(yù)混物組成及反應(yīng)條件見表2。表2巢式第二步PCR反應(yīng)預(yù)混物組成及反應(yīng)條件試劑25μL體系（μL）50μL體系（μL）10×PCR緩沖液（無Mg2+）2.55MgCl2(25mmol/L)24DNA模板（第一步PCR產(chǎn)生稀釋1000倍）0.51dNTP(10mmol/L)12100ng/μL引物F2：5’-TTGGCGGCACAATTCTCAAACA-3’12100ng/μL引物R2：5’-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3’12TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.250.5滅菌雙蒸水16.7533.5擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃30s、64℃30s、68℃20s，20次循環(huán)；68℃終延伸5min。4℃保溫。產(chǎn)物大?。?48bp7.3.3甲殼類動(dòng)物內(nèi)參基因PCR的反應(yīng)模板為抽提的南美白對(duì)蝦樣品DNA，其反應(yīng)預(yù)混物組成及反應(yīng)條件見表3。表3甲殼動(dòng)物內(nèi)參基因PCR反應(yīng)預(yù)混物組成及反應(yīng)條件試劑25μL體系（μL）50μL體系（μL）10×PCR緩沖液（無Mg2+）2.55MgCl2(25mmol/L)24DNA模板0.51dNTP(10mmol/L)12100ng/μL引物F：5’-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3’12100ng/μL引物R：5’-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3’12TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.250.5滅菌雙蒸水16.7533.5擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，35次循環(huán)；72℃終延伸5min。4℃保溫。產(chǎn)物大?。?48bp7.3.4分別配制好100份~1000份第一步PCR、第二步PCR和甲殼類動(dòng)物內(nèi)參基因PCR的無TaqDNA聚合酶的反應(yīng)預(yù)混物，按10份/支、100份/支對(duì)無酶反應(yīng)預(yù)混物分別分裝，凍存于-20℃。7.3.5檢測(cè)前，取出所需份數(shù)的PCR無酶預(yù)混物解凍，按比例分別加入所需的Taq酶量，混勻；按1份/支將預(yù)混合物分別分裝到0.2mLPCR管中待用。7.4PCR操作7.4.1巢式第一步PCR按照表1在含Taq酶的預(yù)混物PCR管中分別加入相應(yīng)量樣品DNA、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照模板，然后按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。7.4.2巢式第二步PCR按照表2在含Taq酶的預(yù)混物PCR管中分別加入相應(yīng)量稀釋后的第一步PCR產(chǎn)物，然后按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。7.4.3甲殼類動(dòng)物內(nèi)參基因PCR（除南美白對(duì)蝦樣本外，其他樣本不執(zhí)行此步驟）按照表3在含Taq酶的預(yù)混物PCR管中分別加入相應(yīng)量樣品DNA、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照模板，然后按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。7.5PCR產(chǎn)物分析7.5.1瓊脂糖凝膠制作7.5.1.1用1×電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖凝膠，裝于250mL三角瓶中，膠液體積應(yīng)少于容器體積的1/4，在電爐上或微波爐中加熱至溶液完全透明。待溶液冷卻至60℃左右，按要求加入核酸染料，搖勻。7.5.1.2將凝膠液緩緩倒入設(shè)置好的水平放置的凝膠船，膠液厚度0.6cm～0.8cm。梳底部水平深入膠層約0.3cm～0.5cm，并距凝膠底部0.2cm。7.5.1.3待凝膠完全凝固后，小心拔掉梳齒，去掉防漏條/套。7.5.2電泳PCR產(chǎn)物電泳參照SC/T7202.2—2007中7.1.6執(zhí)行。7.5.3結(jié)果的分析和問題排除電泳結(jié)果的分析和問題排除方法參見GB/T25878—2010附錄B。8結(jié)果判定8.1陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均檢測(cè)準(zhǔn)確的條件下檢測(cè)結(jié)果有效（若樣品為南美白對(duì)蝦還需同時(shí)滿足甲殼動(dòng)物內(nèi)參基因有檢出），若樣品巢式第一步PCR產(chǎn)物在514bp處有特定條帶，或巢式第一步無特定條帶但第二步PCR產(chǎn)物在148bp處有特定條帶，該樣品判定陽性，若兩步PCR均無特