3.3通過(guò)細(xì)胞融合可產(chǎn)生具有新特性的細(xì)胞（教學(xué)課件）-高二生物（浙科版2019選擇性必修3）

第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過(guò)化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過(guò)化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第三章動(dòng)物細(xì)胞工程第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第三節(jié)通過(guò)細(xì)胞融合可產(chǎn)生具有新特性的細(xì)胞目

錄細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用與植物體細(xì)胞雜交技術(shù)中的原生質(zhì)體融合類似，動(dòng)物細(xì)胞工程中也包括細(xì)胞融合技術(shù)。

那么，兩個(gè)動(dòng)物細(xì)胞是如何融合成一個(gè)細(xì)胞？融合技術(shù)有什么應(yīng)用？1.概念：2.范圍：在一些融合因子的作用下，將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞融合技術(shù)①基因型相同的細(xì)胞間②基因型不同的同種生物細(xì)胞間3.誘導(dǎo)方式？③親緣關(guān)系非常遠(yuǎn)的不同種生物細(xì)胞間因?yàn)樵|(zhì)體不會(huì)自動(dòng)融合，想想植物細(xì)胞融合有哪些方法？①物理法：電刺激、離心、振動(dòng)②化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)1875年，科學(xué)家們首次觀察到了脊椎動(dòng)物（蛙）血液細(xì)胞的融合現(xiàn)象。1958年，日本科學(xué)家崗田用滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)人的腹水癌細(xì)胞融合成功。①物理法：電流刺激（電脈沖）、激光融合②化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)③生物法：滅活的病毒（動(dòng)物細(xì)胞融合特有）3.誘導(dǎo)方式一、兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可融合形成一個(gè)細(xì)胞滅活的病毒誘導(dǎo)機(jī)理什么是滅活的病毒？滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面↓細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通↓細(xì)胞膜連接↓細(xì)胞核融合，形成雜交細(xì)胞病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞發(fā)生融合4.誘導(dǎo)機(jī)理/原理：細(xì)胞膜出現(xiàn)一定程度損傷，細(xì)胞相互粘連而融合。細(xì)胞膜的流動(dòng)性5.結(jié)果：形成的雜交細(xì)胞具有原來(lái)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息。6.意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和7.應(yīng)用：（1）在染色體基因定位上的應(yīng)用（2）制備單克隆抗體植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能2024/4/4動(dòng)物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較二、細(xì)胞融合技術(shù)是制備單克隆抗體的基礎(chǔ)1.早期獲得抗體的方法向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原從動(dòng)物血清中分離所需抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差（能識(shí)別多種抗原）缺點(diǎn)：多克隆抗體思考：1.抗體的本質(zhì)是什么？如何產(chǎn)生的？2.用傳統(tǒng)的方法如何獲取抗體？3.此方法能否快速、大量獲取我們想要的某種抗體？為什么？二、細(xì)胞融合技術(shù)是制備單克隆抗體的基礎(chǔ)2.單克隆抗體B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下不能無(wú)限增殖克隆單一的B淋巴細(xì)胞，得到的細(xì)胞群就能分泌出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體制備思路：困難：若要得到大量的單一抗體，我們?cè)撊绾稳プ觯抠Y料：人們發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物發(fā)生免疫反應(yīng)的過(guò)程中，體內(nèi)有上億種B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生多達(dá)百萬(wàn)種以上的特異性抗體，但是每一種B淋巴細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用克隆單個(gè)B淋巴細(xì)胞形成細(xì)胞群。米爾斯坦科勒

由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術(shù)，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)大膽設(shè)想：B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（能產(chǎn)生抗體）（能大量增殖）融合細(xì)胞（既能產(chǎn)生抗體，又能大量增殖）

他們利用仙臺(tái)病毒使經(jīng)羊紅細(xì)胞免疫的、從小鼠脾臟分離的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。壽命有限的B淋巴細(xì)胞與具有無(wú)限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選后就可以獲得既能產(chǎn)生特異性抗體，又能在正常培養(yǎng)條件下進(jìn)行無(wú)限增殖的雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，就能長(zhǎng)久地得到針對(duì)羊紅細(xì)胞的單克隆抗體了。（1）單克隆抗體制備的過(guò)程：2024/4/4注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞從脾中提取B淋巴細(xì)胞多種骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合能產(chǎn)生抗體，但不能大量增殖不能產(chǎn)生抗體，但能大量增殖PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法目的是獲得產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞多種雜交細(xì)胞：未融合的細(xì)胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次篩選：用特定的HAT選擇培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)多種雜交瘤細(xì)胞：（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）（能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）此雜交瘤細(xì)胞包括能分泌所需抗體的細(xì)胞和產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞。如何篩選？閱讀教材P82-83課外讀多種雜交細(xì)胞：未融合的細(xì)胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次篩選：用特定的HAT選擇培養(yǎng)基雜交瘤細(xì)胞：（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）第二次篩選：克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)（可進(jìn)行多次）抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)多孔細(xì)胞培養(yǎng)板（能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)抗體檢測(cè)板多孔細(xì)胞培養(yǎng)板陽(yáng)性孔抗體檢測(cè)的方法——抗原-抗體雜交法將雜交瘤細(xì)胞群稀釋（極限稀釋），約每孔1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間后，檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔分泌抗體能跟特定抗原結(jié)合的細(xì)胞即為所需雜交瘤細(xì)胞知識(shí)拓展：篩選獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆培養(yǎng)抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提?。墚a(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）第一次篩選第二次篩選原因方法結(jié)果誘導(dǎo)融合后得到的細(xì)胞中，除雜交瘤細(xì)胞之外，還有未融合的親本細(xì)胞，也有融合的具有同種核的細(xì)胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)第一次篩選之后獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞用特定的HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，在每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)（進(jìn)行多次篩選）篩選獲得雜交瘤細(xì)胞獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞兩次篩選的比較應(yīng)用到的技術(shù)：原理：

細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、細(xì)胞增殖多種雜交細(xì)胞及未融合的細(xì)胞誘導(dǎo)

融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選足夠數(shù)量的能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）（產(chǎn)生抗體）（能無(wú)限增殖）從腹腔液中提取從培養(yǎng)液中提取歸納：（可進(jìn)行多次）動(dòng)物細(xì)胞融合、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生所需（特異性）抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆培養(yǎng)的途徑：體外和體內(nèi)將培養(yǎng)液離心獲取抗體，并進(jìn)一步分離、純化、檢測(cè)便可獲得單克隆抗體可用于免疫標(biāo)記測(cè)定，若用于日常診斷、或定性研究不需純化。（液體里還有各種氨基酸、維生素、指示劑蛋白質(zhì)、核酸、毒素和病毒）純度高，可大量制備，在應(yīng)用時(shí)具備特異性強(qiáng)、靈敏度高。如利用脊髓灰質(zhì)炎病毒的單克隆抗體做診斷試劑（2）單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：(3)單克隆抗體的應(yīng)用①?gòu)V泛用作診斷試劑②直接用于治療疾病。實(shí)例：利妥昔單抗（美羅華）是一種針對(duì)CD20抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體，是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療的單抗。進(jìn)入人體后能通過(guò)介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用和抗體與CD20分子結(jié)合引起的直接效應(yīng)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，改變細(xì)胞周期以及凋亡等方式殺死淋巴瘤細(xì)胞。使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒(méi)有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過(guò)將細(xì)胞毒素與能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細(xì)胞毒素)三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示?？贵w藥物接頭ADC被細(xì)胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細(xì)胞凋亡單克隆抗體+藥物=“生物導(dǎo)彈”(“生物導(dǎo)彈”—單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭)優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用?、圻\(yùn)載藥物：如ADC。思考：?jiǎn)慰寺】贵w的制備過(guò)程中的幾個(gè)問(wèn)題：（2）兩次篩選的目的相同嗎？（1）給小鼠注射抗原的目的是什么？（3）三次培養(yǎng)的目的是什么？（4）該過(guò)程運(yùn)用了哪些技術(shù)？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)。誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)