高三生物二輪復(fù)習專題五DNA的粗提取與鑒定

專題5課題1《DNA的粗提取與鑒定》DNA的粗提取與鑒定DNA從哪提取？怎樣將DNA與細胞中的其他物質(zhì)分離？怎樣鑒定我們提取的DNA？原理選材步驟鑒定基本思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性

質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。提取原理2、DNA的溶解性DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線蛋白質(zhì)在NaCl溶液中的溶解度曲線析出溶解溶解析出0.14mol/L

NaCl溶液2mol/L

NaCl溶液提取思路：選擇適當?shù)柠}濃度使DNA充分溶解，而雜質(zhì)沉淀，

或者相反，以初步分離的目的。1.血細胞在蒸餾水中會滲透吸水過度而導(dǎo)致細胞膜和細胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。DNA不溶于酒精，但細胞質(zhì)中某些蛋白質(zhì)溶于酒精。DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。——將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離①蛋白酶——水解蛋白質(zhì)，②高溫——大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃③洗滌劑——瓦解細胞膜——對DNA無影響——而DNA在80℃以上才會變性——但對DNA沒有影響提取原理提取原理二、DNA的鑒定試劑：條件：現(xiàn)象：二苯胺沸水浴沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍色鑒定原理實驗設(shè)計實驗材料的選取破碎細胞，獲取含DNA的濾液除去濾液中的雜質(zhì)(純化)DNA的析出與鑒定實驗設(shè)計【1】實驗材料的選取魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。你會選哪種材料進行實驗？思考題：能否選用牛、羊、豬紅細胞血做實驗材料？為什么？常用材料：新鮮的雞血不能，哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得雞血細胞極易吸水脹破實驗設(shè)計【2】破碎細胞，獲取含DNA的濾液(1)制備雞血細胞液取0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液100ml置于500ml燒杯中，加雞血180ml，用玻璃棒緩慢攪拌，離心2~3min，除去上清液。防止血液凝固(2)破碎細胞，獲取含DNA的溶液向雞血中加入20ml蒸餾水，單向快速攪拌，最后用1~2層紗布過濾。使細胞吸水漲破，釋放胞內(nèi)物質(zhì)核液第一次過濾，得到雜質(zhì)較多的DNA溶液。若是植物細胞需要先用一定的洗滌劑溶解細胞膜。提取洋蔥DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作有利于DNA的溶解1、為什么植物細胞要用洗滌劑溶解細胞膜？2、為什么加入蒸餾水可以使雞血細胞破裂？因為植物細胞有細胞壁，吸水不會脹破。因為細胞內(nèi)液的濃度大于外界溶液的濃度即細胞內(nèi)滲透壓高于外界滲透壓，細胞一直吸水。實驗設(shè)計【3】除去濾液中的雜質(zhì)(純化)利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，可以通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)。在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2mol/L，過濾除去不溶的雜質(zhì)，再加入蒸餾水，調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L，析出DNA，過濾除去溶液中的雜質(zhì)，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA?！痉桨敢弧緿NA再溶解第二次過濾，除去蛋白質(zhì)沉淀第三次過濾，除去蛋白質(zhì)濾液實驗設(shè)計【3】除去濾液中的雜質(zhì)(純化)直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)10~15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)?！痉桨付繉V液放在60~75℃的恒溫水浴箱中保溫10~15min，注意嚴格控制溫度范圍?！痉桨溉克伎碱}：方案二與方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開方案三：利用DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，使蛋白質(zhì)變性，

與DNA分離實驗設(shè)計【4】DNA的析出與鑒定與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分數(shù)95％)，靜置2－3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水。(1)DNA的析出動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。由于玻璃表面帶電荷，DNA中的磷酸基業(yè)帶電荷而被吸附于玻璃表面，故實驗中用塑料杯和試管可減少損失。實驗設(shè)計【4】DNA的析出與鑒定鑒定DNA時在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4ml試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍色。(2)DNA的鑒定現(xiàn)配現(xiàn)用實驗設(shè)計本實驗中有三次過濾,獲得什么？過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細胞液過濾含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液

過濾溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液獲得含核物質(zhì)的濾液獲取紗布上的DNA粘稠物得到含DNA的濾液實驗設(shè)計實驗中有五次用玻璃棒攪拌?分別有什么作用?第一次攪拌加蒸餾水的雞血細胞液第二次攪拌加2mol/LNaCl溶液的濾液第三次攪拌加蒸餾水至0.14mol/LNaCl溶液第四次攪拌放入2mol/LNaCl溶液中紗布上的粘稠物第五次攪拌體積分數(shù)為95%的酒精加速了雞血細胞的破裂，從而釋放出DNA目的是使DNA充分溶解在2mol/LNaCl溶液中稀釋NaCl溶液,析出DNA黏稠物使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中卷起DNA絲狀物，獲取含雜質(zhì)較少的DNA實驗設(shè)計本實驗兩次析出DNA：第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液析出DNA。第二次：用冷卻的95％的酒精，獲得含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物除去溶液中的雜質(zhì)實驗操作1、加蒸餾水破碎細胞，得到含有較多雜質(zhì)的DNA濾液2、加2mol/LNaCl溶液，去除蛋白質(zhì)沉淀，得到較純的DNA濾液3、加蒸餾水，NaCl溶液濃度變?yōu)?.14mol/L，得到DNA粘稠物5、加95%酒精，得到白色絲狀物——DNA4、加2mol/LNaCl溶液，溶解DNA粘稠物原理：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液的溶解度不同，DNA在0.14mol/LNaCl溶液時的溶解度最低。DNA不溶于酒精，但細胞質(zhì)中某些蛋白質(zhì)溶于酒精。專題5課題2《多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片斷》基礎(chǔ)知識C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）脫氧核苷酸一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH”和另一個核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’，5’-磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端游離的-OH端為3′端游離的磷酸基團的末端為5′端（1）DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。4.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點：（2）

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。（3）兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤（A）一定與

配對，鳥嘌呤（G）一定同

配對。兩條反向平行雙螺旋脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）（二）DNA的復(fù)制：1.概念：由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程。2.時期：有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場所：細胞核（主要）、線粒體、葉綠體4.基本條件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸（dNMP）模板:DNA的兩條鏈5.復(fù)制特點：a.邊解旋邊復(fù)制b.半保留復(fù)制6.遵循原則：堿基互補配對原則7.精確復(fù)制的原因a.規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板b.堿基互補配對保證了復(fù)制準確無誤的進行8.復(fù)制的意義:DNA分子通過復(fù)制將遺傳信息從親代傳給了后代，保持了遺傳信息的連續(xù)性。參與的組分在體內(nèi)復(fù)制的作用p58PCR技術(shù)p62解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物打開DNA雙鏈（氫鍵）提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈(磷酸二酯鍵)使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸變性TaqDNA聚合酶（耐高溫）20～30個核苷酸構(gòu)成DNA或RNA含有Mg2+的緩沖液一、PCR的反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/pcr過程細胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR相同點①提供DNA模板②四種脫氧核苷酸作原料③子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端細胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外DNA擴增(PCR技術(shù))的比較1、PCR利用了DNA的

原理。2、DNA的合成方向總是從子鏈的

端向

端延伸。3、PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)的基本步驟可以分為

三步。4、DNA呈

增長。熱變性5′變性、復(fù)性、延伸3′指數(shù)細胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外DNA擴增(PCR技術(shù))的比較細胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR不同點解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶酶解旋酶，DNA聚合酶，DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加溫度體內(nèi)溫和條件高溫子鏈合成一條鏈連續(xù)(先導(dǎo)鏈)，另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連接(滯后鏈)兩條子鏈均連續(xù)合成復(fù)制特點半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。二、PCR實驗操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質(zhì)上是能夠自動調(diào)控溫度的儀器4、離心機一種通過高速轉(zhuǎn)動產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開的設(shè)備。（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（準備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步驟：三、實驗結(jié)果測定實驗中DNA含量1、原理通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2、過程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計算DNA含量（

g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)課堂小結(jié)多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計算專題5課題3《血紅蛋白的提取和分離》思考1、分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。2、蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。p543、高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)4、人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。一、基礎(chǔ)知識：㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行分離。3、原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對（）的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。4、具體過程相對分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快凝膠顆粒相對分子量小—容易進入通道—路程長—移動慢---后洗脫出來相對分子量大—無法進入通道—路程短—移動快---先洗脫出來凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理由弱酸和相應(yīng)的強堿鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等㈡緩沖溶液－－洗脫劑

（1）作用：

（2）配制：抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。（3）在血紅蛋白的提取和分離實驗中用的緩沖液的原因？

目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能。

2、原理：電泳利用了待分離樣品中各種分子（）以及分子本身（）、（）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（），從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。3、分類：瓊脂糖凝膠電泳和(SDS-)聚丙稀酰胺凝膠電泳。（四）血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細胞中________細胞數(shù)量最多，細胞的含量最高的化合物是_____________。該化合物是由___________