抗原抗體間的專一結(jié)合關(guān)系

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay

免疫酵素連結(jié)反應(yīng)Enzyme-LinkedImmunosorbentAs1ELISA的概念抗原抗體間的專一結(jié)合關(guān)係原理與免疫染色法類似，是利用抗體的專一性去偵測抗原量的多寡，並以酵素為放大信息的標(biāo)示，因此有相當(dāng)高的靈敏度；因為使用固相，故操作較為方便，同時可處理大量樣本，但解析力不及電泳轉(zhuǎn)印的免疫染色法。ELISA的概念抗原抗體間的專一結(jié)合關(guān)係2ELISA的起源1959年由BersonandYellow基於生物分子抗原性，利用抗原抗體反應(yīng)的專一性和高靈敏度來作生物分子的定量，並提出放射免疫分析(Radio-immunoassay,RIA)技術(shù)與理論。1967年Catt和Tregear等人首先提出以抗體吸附在塑膠管內(nèi)壁來進(jìn)行固定相放射免疫分析的理論，以便游離態(tài)與結(jié)合態(tài)的分離。BersonSAandYellowRSQuantitativeAspectoftheReactionBetweenInsulinandInsulinBindingAntibody.JClinInvest1959;38:1996-2016.CattKandTregearGWSolid-PhaseRadioimmunoassayInAntibodyCoatedTubes.Science1967;158:1570-1572.ELISA的起源1959年由BersonandYello3細(xì)胞體液兩種方式巨噬細(xì)胞(Macrophage)自然殺手細(xì)胞(Naturalkillercell)干擾素(Interferon)T細(xì)胞

B細(xì)胞生

產(chǎn)抗體兩大系統(tǒng)先天免疫系統(tǒng)後天免疫系統(tǒng)背景理論細(xì)體兩巨噬細(xì)胞干擾素(Interferon)T細(xì)胞生4免疫反應(yīng)初級反應(yīng)Primaryresponse次級反應(yīng)Secondaryresponse抗原抗原時間免疫反應(yīng)免疫反應(yīng)初級反應(yīng)次級反應(yīng)抗原抗原時間免5初次入侵再次入侵初級反應(yīng)次級反應(yīng)記憶細(xì)胞記憶細(xì)胞抗原抗原作用細(xì)胞作用細(xì)胞初次入侵再次入侵初級反應(yīng)次級反應(yīng)記憶細(xì)胞記憶細(xì)胞抗原抗原6抗體抗體由四條蛋白質(zhì)長短鍊所組成抗體分子上有兩個抗原結(jié)合區(qū)抗體與抗原結(jié)合是專一性的IgGImmunoglobulin抗體IgGImmunoglobulin7IgM五元體IgA二元體IgM五元體IgA二元體8抗原決定位

Epitope一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定位每個抗原決定位至少誘發(fā)一種專一性抗體蛋白質(zhì)性抗原決定位含有六個以上胺基酸抗原決定位

Epitope9BBB抗原MultivalentAntigen1223344一個B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一抗原決定位。若有許多抗原決定位，則需許多個B細(xì)胞分別生產(chǎn)許多抗體。BB親和力成熟1抗原決定位BBB抗原1223344一個B細(xì)胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一10抗原的種類蛋白質(zhì)人工合成勝肽小分子稱為半抗原Hapten，需要和大分子的蛋白質(zhì)載體Carrier螯合，方得進(jìn)行免疫?？乖姆N類蛋白質(zhì)11小分子抗原的製備載體的選擇BovineSerumAlbumin,HumanSerumAlbumin,Ovalbumin,KeyholeLimiptHemocyanine等。螯合方法去除未結(jié)合部份透析小分子抗原的製備載體的選擇12螯合方法

ConjugateMethodGlutaraldehyde(GA)MethodCarbodiimide(CD)MethodMixedAnhydrideMethod螯合方法

ConjugateMethod13ConjugateMethodTypeofBondReactivegroupinhaptenutilizedforcouplingGlutaraldehydeMethodR1-NH-CH(OH)(CH2)3CH(OH)NH-R2-NH2or-COOHCarbodiimideMethodR1-CONH-R2-NH2or-COOHMixedAnhydrideMethodR1-CONH-R2-NH2or-COOHReactivegroupinhapten14GAMethodAmoxicillinGlutaraldehydeCarrierGAMethodAmoxicillinGlutaralde15AmoxicillinGlutaraldehydeAmoxicillinGlutaraldehydeCondensationPolymerization

AdditionPolymerization

H2OCarrierAmoxicillinGlutaraldehydeAmoxi16HRPN-Hydroxysuccinimide

NHS1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimideEDCAmoxicillinCDMethodHRPHRPN-Hydroxysuccinimide1-Ethy17免疫流程免疫免疫動物兔,鼠,雞,羊等免疫部位皮下,肌肉,脾內(nèi)佐劑完全佐劑和不完全佐劑次數(shù)取得抗體處理儲存免疫流程免疫取得抗體18多株抗體vs.單株抗體同一個抗原決定位，可有不同的B細(xì)胞反應(yīng)，因此產(chǎn)生不同程度親和力的抗體?；蛞粋€抗原有不同的抗原決定位，因此對一個抗原，可以有一群抗體認(rèn)識它，這些抗體的親和力不一樣，所結(jié)合的抗原決定位也可以不一樣，但都對這大抗原能結(jié)合，這就是多株抗體PolyclonalAntibody。單株抗體MonoclonalAntibody是透過細(xì)胞融合技術(shù)，可以使一個B細(xì)胞變成一個融合瘤hybridoma，並使其單株化monoclonal，再篩選產(chǎn)生高親和力的抗體，因此單株抗體是均質(zhì)性的(homogeneous)。多株抗體vs.單株抗體同一個抗原決定位，可有不同的B細(xì)胞反應(yīng)19單株抗體只要細(xì)胞株存在，就可以一直生產(chǎn)該抗體，可以視為一種固定的試劑，不會隨著個體不同而有變化。單株抗體只含有一種抗體，無法與抗原產(chǎn)生免疫沈澱。單株抗體與抗原的結(jié)合部位通常只有一處，因此整體的結(jié)合力量可能不如多株抗體。單株抗體的專一性較好，且可控制所要對抗的抗原決定基位置。單株抗體只要細(xì)胞株存在，就可以一直生產(chǎn)該抗體，可以視為一種固20專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgAxyzAgB1’20

AgA’123123123專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?12321AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.58123412341234多株抗體AdaptedfromMilstein(1980)S22單株抗體12341234mmmm12341234+單株抗體12341234mmmm12341234+23細(xì)胞融合

CellFusion此關(guān)鍵技術(shù)是1980年代，由Kohler與Milstein兩位科學(xué)家在英國劍橋大學(xué)所研發(fā)，往後數(shù)十年無論在基礎(chǔ)研究或醫(yī)學(xué)應(yīng)用上都有很大貢獻(xiàn)，也一起獲得諾貝爾獎(1984年)。B細(xì)胞與骨髓癌細(xì)胞融合的方法。因為一般的B細(xì)胞無法在培養(yǎng)皿中活太久，因此不能如上述大量培養(yǎng)B細(xì)胞；而骨髓癌是一種淋巴癌細(xì)胞，與B細(xì)胞的背景相似，並且可以在培養(yǎng)皿中永久繼代下去，具有長生不死的特性。若將這兩種細(xì)胞混合，並以化學(xué)試劑PEG(polyethyleneglycol)誘導(dǎo)其相互融合，兩組染色體混合之後可能產(chǎn)生重組，當(dāng)細(xì)胞分裂數(shù)次之後，染色體數(shù)目回復(fù)正常，將可能有子代細(xì)胞同時兼具分泌抗體及長生不死兩種特性，稱為融合瘤(hybridoma)。細(xì)胞融合

CellFusion此關(guān)鍵技術(shù)是1980年代24純化抗體硫酸銨AmmoniumSulfate沉澱收集約40%飽和度的沉澱，是最經(jīng)濟(jì)、方便的方法。離子交換用DEAE陰離子交換法，多用在純化IgG。膠體過濾法以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化IgM。親和層析法以ProteinA專一性地吸住IgG。純化抗體硫酸銨AmmoniumSulfate沉澱25其他產(chǎn)生抗體的技術(shù)選擇目標(biāo)蛋白質(zhì)上具有較強(qiáng)抗原性的一個片段，再以人工方法合成出這條勝肽後，接到carrier，然後免疫產(chǎn)生多株抗體。因為只會對抗一段很短的蛋白質(zhì)片段，有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性，特稱之為單專一性抗體(monospecificAb)。其他產(chǎn)生抗體的技術(shù)選擇目標(biāo)蛋白質(zhì)上具有較強(qiáng)抗原性的一個片段，26噬菌體表現(xiàn)(phagedisplay)取代傳統(tǒng)的細(xì)胞融合方法，得到類似單株抗體的專一性探針。利用噬菌體的外殼蛋白基因為架構(gòu)，插入抗體基因上與抗原結(jié)合區(qū)的部份，然後在重組後噬菌體基因庫中篩選，找出可以表現(xiàn)對抗原具有高專一性結(jié)合的噬菌體。將目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因植在某種表現(xiàn)質(zhì)體中，再以基因槍打入肌肉細(xì)胞中，此基因可以在體內(nèi)表現(xiàn)出目標(biāo)蛋白質(zhì)，引發(fā)產(chǎn)生抗體或者細(xì)胞免疫。噬菌體表現(xiàn)(phagedisplay)取代傳統(tǒng)的細(xì)胞融27ELISA的原理固相免疫分析固定相種類微滴定盤(microtiterplate)亞硝基樹脂(nitrocellulose)耐龍薄膜(nylonmembrane),cellulosenitrateester(nitrocellulose;NC),polyvinylidenedifluoride(PVDF)聚苯乙烯球(polystyrenebead)及微粒子(microparticle)ELISA的原理固相免疫分析28蛋白質(zhì)vs.固定相蛋白質(zhì)和聚乙烯的結(jié)合為共價鍵結(jié)。50μL/well蛋白質(zhì)在常溫常壓下培養(yǎng)2hr，每well可接上100ng，亦即300ng/cm2,4-37℃,pH6-9中進(jìn)行皆可。平均1wellIgG約加入1000ng/200μL即可達(dá)飽合。蛋白質(zhì)分子量與親和力成正比。蛋白質(zhì)vs.固定相蛋白質(zhì)和聚乙烯的結(jié)合為共價鍵結(jié)。29固定原理被動吸附廣泛應(yīng)用在聚苯乙烯球，微滴定盤之ELISA分析或薄膜之免疫轉(zhuǎn)漬分析中。

共價結(jié)合常用在親水性珠子(比如agarose)。

免疫化學(xué)固定及非吸附性非共價鍵鍵結(jié)streptavidin-biotin連接或使用細(xì)菌性IgG結(jié)合蛋白，比如蛋白A。固定原理30抗原vs.抗體抗體對抗有特異性的結(jié)合(specificity),主要是靠氫鍵(hydrogenbonding)，靜電力(electrostatic)，凡得瓦爾力(VanderWaals)，及疏水性鍵結(jié)(hydrophobicforce)以非共價鍵(non-covalentbond)的方式結(jié)合。影響蛋白質(zhì)構(gòu)造的條件皆會影響抗原和抗體的結(jié)合(antigen-antibodybinding)溫度，離子濃度(ionicstrength)及酸鹼值(pH)抗原vs.抗體抗體對抗有特異性的結(jié)合(specificity31ELISA酵素呈色系統(tǒng)HorseradishPeroxidaseAlkalinePhosphatasebeta-galactosidaseGlucoseOxidaseGlucose-6-phosphateDehydrogenaseELISA酵素呈色系統(tǒng)HorseradishPeroxid32選擇酵素的考量純度高催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高對受質(zhì)專一性強(qiáng)價格不貴操作便利易於螯合穩(wěn)定度螯合後保持活性及催化能力在樣品中無此酵素對應(yīng)的受質(zhì)易於製備及保存,價格低廉,有色產(chǎn)物易於測定選擇酵素的考量純度高穩(wěn)定度33酵素vs.受質(zhì)HRPOPDO-phenylenediamineABTS2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)HPPA3-(4-hydroxy)phenlypropionicacidTMB3,3’,5,5-TetramethylbenzidineALPp-NPPp-nitrophenylphosphatePhosphate4-mehtylumbelliferonebeta-galactosidase4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside酵素vs.受質(zhì)HRP34β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone），可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘