雪蓮細胞培養(yǎng)及類黃酮化合物生物合成的調(diào)控

雪蓮細胞培養(yǎng)及類黃酮化合物生物合成的調(diào)控報告提綱一、雪蓮花的研究背景二、雪蓮植物愈傷組織誘導

三、雪蓮高產(chǎn)黃酮細胞系的篩選四、雪蓮細胞的固體、懸浮培養(yǎng)（搖床、發(fā)酵罐）五、雪蓮細胞培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化六、誘導子在雪蓮細胞培養(yǎng)中的應用七、毛狀根培養(yǎng)技術八、轉基因技術在雪蓮中的應用九、雪蓮細胞大規(guī)模培養(yǎng)及其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有效成分一、雪蓮花的研究背景（雪蓮的種類及生長環(huán)境）雪蓮屬菊科（Compositae）鳳毛菊屬（SaussureaDC.）雪兔子屬亞屬（SubgenEriocoryne(DC.)）和雪蓮花亞屬（Subgen.AmphilaenaLipsch.）通稱為雪蓮花。我國雪蓮有40多種及3個變種，常被用作生藥的雪蓮植物有12種和1變種。雪蓮花同等入藥，但有優(yōu)劣之分。雪蓮產(chǎn)于西藏、新疆、甘肅、青海、四川及云南等地。雪蓮通常生長在海拔3500~4500米的高山流石灘上，其生長環(huán)境氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫度3-5℃，最低月平均溫度零下19—21℃，年降水量800mm，無霜期僅有50天左右。由于環(huán)境惡劣，雪蓮生長緩慢，4-5年才能開花結實?；ㄆ?月，種子8月成熟。續(xù)一、雪蓮花的主要品種及研究的進展續(xù)一、雪蓮種類與療效1.雪蓮為菊科風毛菊屬多年生草本植物；2.藥效顯著，為我國傳統(tǒng)的珍稀藥用植物資源；3.生境惡劣，被列為國家二級珍稀保護植物；4.新疆雪蓮(Sausureainvolucrata

)

和水母雪蓮(Sausureamedusa)

，用藥歷史悠久，為雪蓮中的上品。功能與主治：民間用于治療風濕性關節(jié)炎、高山不適應和各種婦科疾病等，具有散寒除濕、活血通絡的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明雪蓮還具有強心、抗癌、抗氧化、抗疲勞等功能。

續(xù)一、雪蓮的主要功能和主要成分續(xù)一、雪蓮的主要藥用成份主要藥用成份： 黃酮類、木質素類、生物堿類和多糖類物質；雪蓮黃酮類物質： 芹菜素、木犀草素、槲皮素、異鼠李素、柯伊立素、高車前素、Jaceosidin、花色素及上述物質的糖甙（例如蘆?。?；其他療效顯著的物質：

紫丁香甙、牛蒡子甙、秋水酰堿、雪蓮內(nèi)酯等。續(xù)一、雪蓮的主要藥用成份結構續(xù)一、類黃酮化合物合成途徑二、雪蓮植物愈傷組織誘導（一）、原料植物材料的制備在組織培養(yǎng)中，材料必須完全無菌。有些植物材料的表面有絨毛，消毒劑溶液不容易浸潤到表皮，可以在消毒及處理之前先將材料在70%酒精中浸泡數(shù)十秒，或者在消毒及溶液中加入幾滴表面活性劑T。-80，都會提高殺菌的效果。表面消毒劑對于植物組織也是有毒的。因此要正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以盡量減少組織的死亡。材料在表面消毒處理后，必須在無菌蒸餾水中漂洗3-4次，以除掉所有殘留的殺菌劑，否則就會妨礙愈傷組織的發(fā)生。續(xù)二、雪蓮植物愈傷組織誘導以植物的莖、葉、花或莖尖為材料，應用無菌操作方法，使其在人工條件下，能夠分裂、增殖、分化發(fā)育成一完整植株的過程。植物的組織在人工培養(yǎng)條件下，原來已經(jīng)分化停止生長的細胞，可以重新分裂，形成沒有組織結構的細胞團，即愈傷組織，這一過程稱為“脫分化作用”。而已經(jīng)“脫分化”的愈傷組織，在一定條件下，又能重新分化形成輸導系統(tǒng)以及根和芽等組織和器官，這一過程稱為“再分化作用”。植物激素在“再分化”過程中起著重要作用，生長素和細胞分裂素的比例，決定了根和芽的分化。培養(yǎng)基、植物激素、滅菌等基本實驗操作技術極為重要！續(xù)二、五大類植物激素在組織培養(yǎng)中的作用①生長素；②赤霉素；③細胞分裂素；④乙烯；⑤脫落酸不定根形成的關鍵是其原基的形成,是一個受激素調(diào)控的復雜過程,生長素起關鍵的調(diào)節(jié)作用。介紹生長素、乙烯、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸和其它植物生長調(diào)節(jié)物質在不定根形成中的作用,并討論了它們之間的相互關系。1、生長素：吲哚乙酸促進植物伸長

2、脫落酸：與葉子的衰老、果實的脫落等有關

3、乙烯：促進果實成熟還有生長調(diào)節(jié)劑

4、細胞分裂素：調(diào)節(jié)植物細胞生長和發(fā)育促進細胞分裂

5、赤霉素（GA）

：是廣泛存在的一類植物激素?？纱碳と~和芽的生長。

續(xù)二、細胞分裂素細胞分裂素（cytokinin;kinetin）從玉米或其他植物中分離到的一種N6-異戊烯腺嘌呤。在植物根部產(chǎn)生的一類促進胞質分裂的物質，促進多種組織的分化和生長。與植物生長素有協(xié)同作用。調(diào)節(jié)植物細胞生長和發(fā)育的植物激素。在促進細胞分裂中起活化作用，也包含在細胞生長和分化及其他相關的生理活動過程中，如激動素、玉米素等。細胞分裂素別名：6-BA；6-芐氨基腺嘌呤

三、雪蓮高產(chǎn)黃酮細胞系的篩選

植物細胞培養(yǎng)物這些細胞在核型、結構和大小上各不相同，其代謝狀態(tài)和合成次生代謝物的能力差別也很大。因此，可以利用細胞的異質及變異性篩選出所需要的細胞系。高產(chǎn)細胞系的篩選，通常在愈傷組織團、單細胞克隆或原生質體水平上進行篩選。最簡單的方法是當目的產(chǎn)物為色素類化合物，可以用目視來判斷和篩選。用目視法從水母雪蓮中篩選出比親本高5-6倍的高產(chǎn)黃酮細胞系。然而并不是所有的細胞和組織都象含色素的細胞那樣給人以視覺的直觀的標準，因此單干細胞中跡量代謝物測定的技術成為高產(chǎn)細胞系篩選的關鍵問題，從而出現(xiàn)了放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法、瓊脂小塊法。續(xù)三、雪蓮愈傷組織篩選后的紅色高產(chǎn)系

四、雪蓮細胞的固體、懸浮培養(yǎng)（搖床、發(fā)酵罐）

愈傷組織在外植體上形成以后，應及時從外植體上分離下來，轉入繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。一般情況下，從外植體上分離的愈傷組織須經(jīng)過4～6周的培養(yǎng)才能得到充分的發(fā)育。為了增殖發(fā)育良好的愈傷組織，繼代培養(yǎng)是有效的措施。在良好的培養(yǎng)條件下，愈傷組織可繼代一年以上而不喪失分化能力。影響愈傷組織繼代培養(yǎng)的主要因素是激素。為協(xié)調(diào)繼代培養(yǎng)中既要維持愈傷組織增殖生長良好、又要保持愈傷組織的分化能力的矛盾，就必須篩選最佳的激素濃度。續(xù)四植物細胞系的懸浮培養(yǎng)利用固體瓊脂培養(yǎng)基對植物的離體組織進行培養(yǎng)的方法已經(jīng)得到廣泛的應用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點，如植物的愈傷組織在生長過程中的營養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質呈現(xiàn)一個梯度分布，而利用液體培養(yǎng)基則可以克服這一缺點，我們可以通過震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改善培養(yǎng)基中氧氣的供應。植物細胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。

四、雪蓮細胞的固體、懸浮培養(yǎng)（搖床、發(fā)酵罐）

水母雪蓮細胞固體和懸浮培養(yǎng)特點

微生物細胞

植物細胞

大小小

比微生物大10-100倍

細胞壁

無

有

生長形態(tài)學

單細胞或菌絲體粘連

細胞通常5-1000個粘連成塊，有時更大

接種密度要求大小生長速度

快（以小時計）

慢（以天計）

通氣要求

高

低

對剪切力的敏感性

能抗耐

敏感

續(xù)四、微生物細胞與植物細胞在細胞培養(yǎng)上的差異

續(xù)四、雪蓮細胞的發(fā)酵培養(yǎng)（2升的生物反應器）

續(xù)四、植物細胞懸浮培養(yǎng)溶氧的影響

在植物細胞懸浮培養(yǎng)中，溶氧對細胞的生長和代謝有很大的影響，同時，在培養(yǎng)條件中溶氧也是最復雜的因素之一，溶氧有一定的極限，過高或過低都會影響到細胞生長和產(chǎn)物合成，特別是在高密度培養(yǎng)時，供氧不足往往可能是限制產(chǎn)量的主要因素之一，因此溶氧參數(shù)的調(diào)控對于植物細胞培養(yǎng)十分關鍵。如氧分壓對三七培養(yǎng)細胞生長以及人參皂苷和多糖合成的影響，發(fā)現(xiàn)高的氧分壓抑制細胞生長，同時也不利于產(chǎn)物的合成。續(xù)四、剪切力對植物細胞懸浮培養(yǎng)的影響植物細胞因其個體大、細胞壁僵脆和具有大的液泡而對剪切敏感，成為植物細胞培養(yǎng)放大的一個主要限制因素.

弄清植物細胞對培養(yǎng)體系流體力學敏感性的調(diào)控機理，對植物細胞培養(yǎng)設計合理的反應器和優(yōu)化操作條件具有重要的作用。植物細胞對流體力學環(huán)境的響應依賴于所施加條件的時間和強度以及細胞本身的生理特性。在實際的反應器培養(yǎng)中尚無法定量剪切力與細胞生理響應之間的關系.

.

續(xù)四、細胞聚集體對植物細胞懸浮培養(yǎng)的影響

在懸浮培養(yǎng)中,一個成功的細胞懸浮培養(yǎng)體系必須滿足懸浮細胞培養(yǎng)物分散性好,細胞團較小,一般由幾十個以下的細胞組成，很少有完全由單細胞組成的懸浮細胞系；二是均一性好,細胞形狀和細胞團大小大致相同,懸浮系外觀為大小均一的小顆粒,在倒置顯微鏡下觀察為體積和形狀大致相同的細胞團。聚集體的大小與繼代條件、環(huán)境條件、反應器構型、培養(yǎng)基組成有關。當然，不同植物種類形成的聚集體大小不同，如水母雪蓮（S.medusa）細胞的聚集體為1~5mm，大部分在0.5~3mm。五、雪蓮細胞培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化

培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養(yǎng)基還含有抗菌素和色素，用于單種微生物培養(yǎng)和鑒定。續(xù)五培養(yǎng)基的分類（1）為適合多種植物的細胞生長及次生代謝產(chǎn)物含量的提高，許多不同種類的培養(yǎng)基被發(fā)展了。按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)進行分類:

液體培養(yǎng)基：一類呈液態(tài)的培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：一類外觀呈固態(tài)的培養(yǎng)基。根據(jù)性質又分為

半固體培養(yǎng)基：指在液體培養(yǎng)基中加入少量的凝固劑而配制成的半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。

脫水培養(yǎng)基：又稱預制干燥培養(yǎng)基，指含有除水分外的一切成分的商品培養(yǎng)基。

續(xù)五培養(yǎng)基主要成分（2）大多數(shù)培養(yǎng)基的成分是由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質和有機附加物等五類物質組成的。無機營養(yǎng)物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素中，氮源通常有硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中用硝態(tài)氮的較多，也有將硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合使用的。生長調(diào)節(jié)包括：(1)植物生長素。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。(2)細胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-芐基嘌呤（6-BA或BAP）和激動素（Kt）。(3)赤霉素。使用的赤霉素只有一種，赤霉酸（GA3）

續(xù)五植物細胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基（3）用于植物細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基成分基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細胞、組織和器官的培養(yǎng)基需要滿足各自的特殊要求。根據(jù)特定的植物種類和培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)基的基本營養(yǎng)成分可作適當?shù)恼{(diào)整。培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基也就是通常所說的培養(yǎng)基，主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Nitsh、Miller、SH等。完全培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基的基礎上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質。如植物生長調(diào)節(jié)物質和其他復雜有機添加物等。續(xù)五培養(yǎng)基制備母液（4）為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對幾十種化學藥品進行稱量，應該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋，即成培養(yǎng)液。(1)大量元素；(2)微量元素；(3)鐵鹽；(4)有機物質；(5)植物激素。注意：生長素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，應先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。

續(xù)五培養(yǎng)基的保存（5）培養(yǎng)基配制完畢后，應立即滅菌。培養(yǎng)基通常應在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在高壓蒸汽滅菌鍋120℃條件下，滅菌20分鐘。經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基應置于10℃下保存，特別是含有生長調(diào)節(jié)物質的培養(yǎng)基，在4～5℃低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的一周內(nèi)使用完，其它培養(yǎng)基最多也不應超過一個月。在多數(shù)情況下，應在消毒后兩周內(nèi)用完。(1)防塵；已經(jīng)滅好菌的培養(yǎng)基要注意防塵；(2)避光：備用培養(yǎng)基應貯于光線較暗處，因為吲哚乙酸等某些物質易見光分解；(3)定期更新。

六、誘導子技術在雪蓮細胞培養(yǎng)中的應用誘導子是一類特殊的觸發(fā)因子，它能夠開啟代謝過程中酶的活性，因而能夠增加次生代謝物的含量，有時甚至可以誘導出新的化合物。誘導子是來自生物的化合物。內(nèi)生誘導子（endogenouselicitor）：來自植物細胞分子真菌誘導子（fungalelicitor）：來自微生物分子，是一類能引起植物細胞合成積累次生代謝物活性的物質。誘導子對植物具有專一性，在生產(chǎn)次生代謝物時就要選擇一種適宜的誘導子。續(xù)六、誘導子種類及篩選誘導子:

能夠誘導植物細胞產(chǎn)生防御反應的物質。種類：

內(nèi)源與外源誘導子； 生物與非生物誘導子； 特異與非特異誘導子。 篩選原則： 近緣細胞系；同類代謝物；信號分子。續(xù)六、茉莉酸甲酯（MJ）在細胞培養(yǎng)體系中的應用

MJ為內(nèi)源的非特異性生物誘導子； MJ能夠誘導細胞中苯丙氨酸裂解酶(PAL)的重新轉錄，刺激黃酮類物質的積累。續(xù)六、雪蓮細胞的生長動態(tài)及黃酮產(chǎn)量變化曲線

續(xù)六、MJ影響雪蓮細胞的生物量MJ對雪蓮細胞PAL活性的影響

七、毛狀根培養(yǎng)技術在雪蓮中的應用

毛狀根：又稱發(fā)狀根，發(fā)根。整體植株或某一器官、組織（包括愈傷組織）、單個細胞，甚至原生質體受到發(fā)根農(nóng)桿菌的感染所產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，是細胞中質粒的T-DNA插入寄主細胞核基因組而得到的表現(xiàn)型，主要是在感染部位上或附近能產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物-毛狀根。毛狀根培養(yǎng)的優(yōu)點：生物合成能力強、穩(wěn)定性高、生長快影響毛狀根生長及次生代謝物形成的因素：常量元素、微量元素、碳源、pH值、光照、溫度、生長調(diào)節(jié)劑或激素。續(xù)七、毛狀根培養(yǎng)技術毛狀根培養(yǎng)優(yōu)勢：來源于單個細胞、生長迅速（>10倍）、激素自養(yǎng)、再生容易、次生代謝物質合成穩(wěn)定且含量高；2.本試驗所用菌種：A4、R1000、R1601和LBA9402。毛狀根篩選路線續(xù)七、預培養(yǎng)時間影響R1601侵染頻率*基本培養(yǎng)基：N6+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.6-5.8。外植體類型為新疆雪蓮葉片。

續(xù)七、菌種及外植體類型影響毛狀根轉化效率續(xù)七、新疆雪蓮毛狀根PCR檢測（A）和Southernblot分析（B）

續(xù)七、新疆雪蓮毛狀根中冠癭堿紙層析分析

續(xù)七、野生雪蓮和雪蓮培養(yǎng)物有效成份含量比較

單位：mg/gdw續(xù)七、培養(yǎng)基類型影響新疆雪蓮毛狀根(HR1601)

生長及紫丁香甙的積累氮源濃度對水母雪蓮毛狀根生長及黃酮類化合物生物合成的影響氨/硝對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響碳源對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響碳源對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響GA3對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響激素組合對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響Temperature(℃)

溫度對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響pH對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響搖床轉速對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響光周期對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響接種對照優(yōu)化MJ(茉莉酸甲酯methyl-jasmonate)添加時間對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響SA(水楊酸salicylicacid）濃度對雪蓮毛狀根生長及黃酮類化合物生物合成的影響SA添加時間對水母雪蓮毛狀根生長

及黃酮類化合物生物合成的影響MJ與SA組合對水母雪蓮毛狀根生長及黃酮類化合物生物合成的影響小結1.R1601，根段(預培養(yǎng)2天)，誘導頻率83%；2.Ri質粒的T-DNA已整合到植物基因組并表達；3.HR1601根系生物量（MS，28d），16倍；總黃酮含量為88.6mg/gdw，紫丁香甙含量43.5mg/gdw，分別為野生新疆雪蓮的2.5倍和87倍。

八、轉基因技術在雪蓮中的應用

通過對次生代謝合成關鍵酶基因的異位表達可以產(chǎn)生不同種類的次生代謝產(chǎn)物或提高含量。研究有效次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，可以人為地對這些化學成分的合成進行生物調(diào)控，有利于定向合成所需要的化學成分

。如，日本科學家Hashimoto等將天仙子胺6-β-羥基化酶基因通過Ri質粒導入茛菪毛根中，茛菪胺含量提高了5倍（Hashimotoetal，1993）

續(xù)八、查爾酮異構酶基因過表達對新疆雪蓮

類黃酮生物合成的調(diào)控

Smchi基因轉化新疆雪蓮毛狀根提高黃酮類物質生物合成的研究研究內(nèi)容

①新疆雪蓮試管苗生根培養(yǎng)③毛狀根培養(yǎng)條件優(yōu)化④轉基因新疆雪蓮毛狀根的PCR檢測⑤轉基因新疆雪蓮毛狀根的PCR-Southern檢測⑥轉基因新疆雪蓮毛狀根的生長能力⑦轉基因雪蓮毛狀根根系的總黃酮和芹菜素的生產(chǎn)⑧Smchi基因表達和CHI酶活性分析②發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導新疆雪蓮遺傳轉化體系建立及優(yōu)化轉基因新疆雪蓮毛狀根的生長能力

(g/L)(g/L)Freshweight(g/L)

Dryweight(g/L)051015C60C57C52C46C41C35C31C29C27C20C18C17C12C7C1Control050100150C60C57C52C46C41C35C31C29C27C20C18C17C12C7C1Control不同新疆雪蓮毛狀根根系的芹菜素和黃酮含量

(mg/L)(mg/L)

Flavonoids(mg/L)Apigenin(mg/L)0.010.020.030.040.0C60C57C52