生物分離工程第緒論

2024/4/12024/4/1課程安排講課32學(xué)時課程考核：期末考試占80%，平時成績占20％。2024/4/1第一章緒論第二章過濾第三章離心與沉降第四章細(xì)胞破碎第五章萃取第六章吸附及離子交換第七章色譜分離第八章沉析第九章膜分離和電泳第十章結(jié)晶與干燥2024/4/1發(fā)酵液預(yù)處理細(xì)胞分離細(xì)胞破碎細(xì)胞碎片分離初步純化胞外產(chǎn)物高度純化成品加工發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離原料預(yù)處理擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基微生物菌株2024/4/1第一章緒論第一節(jié)生物分離工程的性質(zhì)、內(nèi)容與分類

第二節(jié)生物分離工程的一般流程

第三節(jié)生物分離過程的特點

第四節(jié)生物分離工程的發(fā)展歷程和動態(tài)2024/4/1

一、生物分離工程的性質(zhì)

1、生物工程上游：育種、基因工程、細(xì)胞工程、酶工程及發(fā)酵工程下游：生物產(chǎn)品的回收——生物分離技術(shù)第一節(jié)生物分離工程的性質(zhì)、內(nèi)容與分類上游加工過程：功能物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及優(yōu)良物種選育（基因工程、細(xì)胞工程）生物工程中游加工過程：將原料大規(guī)模轉(zhuǎn)化為生物物質(zhì)（酶工程、發(fā)酵工程、動植物細(xì)胞培養(yǎng)）下游加工過程：獲得產(chǎn)品（生化分離）生物技術(shù)各分類間關(guān)系生物技術(shù)上游與下游加工過程2.

生物技術(shù)產(chǎn)品2.1生物技術(shù)產(chǎn)品定義：發(fā)酵、動植物細(xì)胞培養(yǎng)、酶反應(yīng)液和動植物組織細(xì)胞與體液中獲得的產(chǎn)品2.2內(nèi)容：常規(guī)生物技術(shù)產(chǎn)品和現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品2.3特點：（1）具有一定的生理活性－結(jié)構(gòu)復(fù)雜（2）分布廣泛－胞內(nèi)胞外（3）原始濃度（含量）偏低（4）組分復(fù)雜（5）產(chǎn)物穩(wěn)定性差批間差異大（6）質(zhì)量要求高（生物醫(yī)藥）（7）價格貴（經(jīng)濟(jì)性）3.生物分離工程：為提取生物產(chǎn)品時所需的原理、方法、技術(shù)的一門技術(shù)科學(xué)，指從發(fā)酵液、動植物細(xì)胞培養(yǎng)液、酶反應(yīng)液和動植物組織細(xì)胞與體液等中提取、分離純化、富集生物產(chǎn)品的過程

(DownstreamProcessing)。單元操作：

完成一道工序所需的一種方法和手段。

初始原料產(chǎn)品生化分離2024/4/1

生物分離工程原理

分離的本質(zhì)在于有效識別混合物中不同溶質(zhì)間物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的差別。

物理性質(zhì)：力學(xué)、熱力學(xué)、電磁性質(zhì)；

化學(xué)性質(zhì)：化學(xué)熱力學(xué)、化學(xué)反應(yīng)學(xué)、光化學(xué)；

生物學(xué)性質(zhì)：分子識別。分離是混合的逆過程，需要作功才能實現(xiàn)，而且需要有專門過程和設(shè)備。如酒精-水2024/4/1二、生物分離工程的研究內(nèi)容1、生物分離工程主要目標(biāo)產(chǎn)品類型

直接獲得產(chǎn)品、間接獲得產(chǎn)品（1）按產(chǎn)品的相對分子量大小分：小分子：<1000(抗生素、有機(jī)酸、氨基酸）大分子：>1000(酶、抗體、多肽、蛋白質(zhì)）（2）按產(chǎn)品所處的位置分：細(xì)胞內(nèi)：胰島素、干擾素、重組蛋白質(zhì)細(xì)胞外：抗生素、胞外酶2024/4/12、生物分離工程技術(shù)原理的探討

3、生物分離工程設(shè)備的研究

4、生物分離操作過程的設(shè)計與優(yōu)化

2024/4/1

三、生物分離過程的分類可以按被分離物質(zhì)的性質(zhì)分類，也可以按分離過程的本質(zhì)分類。

1、按被分離物質(zhì)的性質(zhì)分類：物理分離法、化學(xué)分離法、物理化學(xué)分離法。

2、分離過程的本質(zhì)分類：

平衡分離過程（根據(jù)不同組分在兩相間分配平衡的差異實現(xiàn)分離）、差速分離過程（利用外加能量強(qiáng)化不同組分遷移的速度差進(jìn)行分離）、反應(yīng)分離過程（利用外加能量或化學(xué)試劑，促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行而達(dá)到分離）。2024/4/1

例：（1）Absorbance1）非特異性吸附抗生素

(吸附)2）特異性吸附抗體

3）親和吸附抗原抗體

4）離子交換抗生素（2）Chromatography1）凝膠抗生素、蛋白質(zhì)

(色譜或?qū)游?2）親和色譜抗體

3）離子交換蛋白質(zhì)（3）ElectricField1）磁性免疫微球抗原抗體

(場致分離)2）區(qū)帶電泳蛋白質(zhì)

3）等速電泳蛋白類

4）等點聚焦電泳蛋白類2024/4/1四、生物分離工程的重要性

1、生物產(chǎn)品特點（1）粗料發(fā)酵：酒精、檸檬酸、酶制劑等；（2）產(chǎn)物濃度低的水溶液

（A、氧傳遞限制；B、細(xì)胞量；C、產(chǎn)物抑制）；（3）組分復(fù)雜（大分子、小分子、可溶物、不可溶物、化學(xué)添加物）；（4）產(chǎn)物穩(wěn)定性差（化學(xué)降解、微生物降解）；（5）質(zhì)量要求高（食品或藥品）；（6）分批操作，生物變異性大。2024/4/12、生物分離工程的重要性（1）生化產(chǎn)品的必經(jīng)的過程。（2）回收率不高?？股?80%左右)，蛋白質(zhì)(60-90%)。（3）分離純化昂貴。分離純化成本占總成本40-80%；藥用產(chǎn)品的成本更高；大多數(shù)酶70%。（4）基因工程的R&D費用，分離純化占50-80%。（5）中藥現(xiàn)代化的重要技術(shù)平臺。生化分析、藥學(xué)等。（6）提高產(chǎn)品競爭力的關(guān)鍵技術(shù)之一。（7）環(huán)境污染的治理。1.體系特殊：（1）試驗方法設(shè)計困難－原料液成分復(fù)雜（2）操作條件要求溫和－目的物穩(wěn)定性差（3）收率低－原料中目的物濃度低、產(chǎn)品純度要求高2.工藝流程（1）操作工藝彈性大－生物變異性大（2）操作條件（環(huán)境）嚴(yán)格、無菌或密封3.成本高五.生物分離工程的特點1.分離的工藝過程原料預(yù)處理初步分離細(xì)胞內(nèi)成品高度純化細(xì)胞外沉淀吸附萃取超濾層析離子交換親和吸附電泳無菌過濾超濾冷凍干燥噴霧干燥結(jié)晶第二節(jié)生物分離工程的一般過程分離裝置分離劑（能量或者物質(zhì)）分離純化過程的一般原則原料產(chǎn)品2024/4/12、產(chǎn)品的分離提取工藝與下列情況有關(guān)（1）是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物；（2）原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的濃度；（3）產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異；（4）產(chǎn)品主要用途和標(biāo)準(zhǔn)；（5）產(chǎn)品的市場價格；（6）廢液的處理方法等。2024/4/1

3、生物分離工藝流程

①發(fā)酵液的預(yù)處理；②提取（初步分離）；

③精制（高度純化）；

④成品制備。主要分離工藝過程原料預(yù)處理初步分離細(xì)胞內(nèi)成品高度純化細(xì)胞外沉淀吸附萃取超濾層析離子交換親和吸附電泳無菌過濾超濾冷凍干燥噴霧干燥結(jié)晶3.1原料的選擇（原則）（1）材料新鮮，目的物含量高如：胰島素、胸腺素、凝乳酶、微生物中的核酸、酶等（2）材料易得，來源豐富（3）穩(wěn)定性好（4）工藝簡單、有綜合利用價值2024/4/13.2預(yù)處理及固液分離（1）預(yù)處理a.動物：去皮、去脂肪，冷凍、干燥b.植物：干燥c.微生物：菌體和菌液（發(fā)酵液）加熱、稀釋、pH、凝聚與絮凝、加助濾劑或反應(yīng)劑（2）固－液分離：過濾、沉降、離心（3）細(xì)胞破碎a.機(jī)械法：勻漿法、球磨法b.非機(jī)械法：E法、化學(xué)法、物理法2024/4/1

（4）發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離

主要技術(shù)有過濾和離心。固液分離是除去發(fā)酵液中的不溶性固形物雜質(zhì)和菌體細(xì)胞。首選過濾，運轉(zhuǎn)費用低。如是胞內(nèi)產(chǎn)物，需進(jìn)行細(xì)胞破碎。2024/4/13.3提?。ǔ醪椒蛛x）

目的是除去與產(chǎn)物性質(zhì)差異較大的雜質(zhì)，便于精制工序生產(chǎn)。要求目的產(chǎn)物有較大的濃縮比過程?？蛇x的單元操作范圍較廣，如吸附、萃取、沉淀、超濾等單元操作。1.吸附法a.原理：范德華力或H鍵b.常用吸附劑：硅膠、活性炭、大孔樹脂等c.應(yīng)用：抗生素等分離、脫色2.離子交換法a.原理：靜電引力b.常用：陰、陽離子交換劑c.應(yīng)用：帶電物質(zhì)如：aa、蛋白質(zhì)、多糖、無機(jī)離子等4.沉淀法：鹽析法、等電點沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、非離子型聚合物、聚電解質(zhì)等5.萃取a.定義：利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的兩相間溶解度不同而進(jìn)行分離的方法。b.種類：溶劑萃取、雙水相萃取、反膠團(tuán)萃取、超臨界流體萃取6.膜分離微濾、超濾、納濾，透析、反滲透、電滲析等2024/4/1

3.4精制（高度純化）目的是除去與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。通常采用對產(chǎn)物有高度選擇性的技術(shù)。層析技術(shù)（色譜技術(shù)）（1）流動相狀態(tài)：GC與HPLC、TLC（2）固定相：柱色譜與薄層色譜（3）原理：離子交換色譜、吸附色譜、凝膠色譜、親和色譜

3.5成品加工（1）濃縮：蒸發(fā)、超濾、反滲透等（2）結(jié)晶（3）干燥：噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥等（4）無菌過濾：2024/4/14、產(chǎn)品收率產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制是分離工程的主線。（1）

φn-總回收率；λn-各單元回收率 分離步驟越多，回收率越低。如φ10=(0.95)10=0.63；φ5=(0.95)5=0.77

（2）分離步驟多，設(shè)備投入大，人員物資消耗大，生產(chǎn)周期長。2024/4/12024/4/12024/4/12024/4/1二、生物分離過程的選擇準(zhǔn)則（1）步驟少；（2）次序合理（例如鹽析、離子交換）；（3）產(chǎn)品規(guī)格（注射、非注射）；（4）生產(chǎn)規(guī)模；（5）物料組成；（6）產(chǎn)品形式（固體適當(dāng)結(jié)晶，液體適當(dāng)濃縮）；（7）產(chǎn)品穩(wěn)定性；（8）物理性質(zhì)：溶解度、分子電荷、分子大小、功

能團(tuán)、揮發(fā)性等；（9）危害性；（10）廢水處理。2024/4/1具體：（1）盡可能簡單、低耗、高效、快速；（2）分離步驟盡可能少；（3）避免相同原理的分離技術(shù)多次重復(fù)出現(xiàn)； 比如，分子篩和超濾技術(shù)按分子量大小分離，重復(fù)應(yīng)用兩次以上，意義就不大了。

2024/4/1（4）盡量減少新化合物進(jìn)入待分離的溶液；

A)引起新的化學(xué)污染；

B)蛋白質(zhì)的變性失活（5）合理的分離步驟次序；原則是：先低選擇性，后高選擇性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。2024/4/1（6）掌握產(chǎn)物的理化性質(zhì)，主要包括：

(A)溶解度及影響因素（溫度、pH值、有機(jī)溶劑和鹽等）；

(B)分子量和分子形狀（高分子物質(zhì)）；

(C)沸點和蒸汽壓（熱穩(wěn)定的小分子物質(zhì)）；

(D)極性大?。?/p>

(E)分子電荷及影響因素（pH和鹽等）；2024/4/1(F)功能團(tuán)（功能團(tuán)為萃取劑和特異性吸附的選擇提供依據(jù)）；(G)免疫原性（設(shè)計親和色譜）；(I)穩(wěn)定性及其影響因素（溫度、pH值、毒性試劑等)；如青霉素低pH的不穩(wěn)定性(J)等電點pI。2024/4/1（7）成品規(guī)格（或產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）五肽胃泌素的上海市藥品標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)名稱指標(biāo)含量（C37H49N7O9S）97.0

比旋光度-25?~-29?

吸收值比A(280nm):A(288nm)=1.12-1.22

氨基酸各氨基酸之比為1

干燥失重，%0.52024/4/1（8）物料的組成和性質(zhì)

(A)目的產(chǎn)物的濃度。高？低？

(B)與目的產(chǎn)物相近物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)。

(C)目的產(chǎn)物的定位。是胞內(nèi)還是胞外？

(D)菌種的種類和形態(tài)。

(E)微生物的含量和發(fā)酵液的黏度。（9）生產(chǎn)規(guī)模（10）分批分離還是連續(xù)純化2024/4/1（11）危害性

(A)離心產(chǎn)生的氣溶膠、發(fā)酵產(chǎn)生的廢氣、干燥產(chǎn)生的粉塵等。

(B)目的產(chǎn)物本身的危害性：抗腫瘤代謝類藥物、類固醇類、抗生素、激素類藥物等。

(C)試劑危害：萃取試劑CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。

(D)微生物的危害：重組DNA工程菌不能任意排放。這一菌種為新的物種，不能排除對生態(tài)系統(tǒng)和人的危害。2024/4/1（12）對環(huán)境影響的考慮

1）廢水

A、除菌過濾和滅菌處理；

B、符合BOD的要求；

2）廢料

A、滅菌處理；

B、綜合利用：動物飼料、飼料添加劑，有機(jī)肥料

2024/4/13）廢氣

A、除菌過濾和滅菌處理；

B、廢氣（有機(jī)溶劑）回收

4）溶劑的回收

A、減少環(huán)境排放，減少污染；

B、循環(huán)利用，減低成本2024/4/1附：抗菌素的分離過程中濃度與純度的變化步驟過程產(chǎn)品濃度（g/L）純度（%）發(fā)酵液發(fā)酵0.1-50.1-1固形物分離過濾1.0-50.2-2分離萃取5-501-10純化色譜50-20050-80產(chǎn)品精制結(jié)晶20-20090-1002024/4/1三、工業(yè)常用的生物分離技術(shù)（1）回收技術(shù)：絮凝、離心、過濾、微過濾等。（2）細(xì)胞破碎技術(shù)：球磨、高壓勻漿、化學(xué)破碎等。（3）初步純化技術(shù)：吸附、離子交換、沉淀（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點、沉淀劑）、萃取