蛋白質(zhì)的研究歷史與方法

關(guān)于蛋白質(zhì)的研究歷史與方法第一節(jié)蛋白質(zhì)研究的歷史回顧

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，protein字源出自希臘文，是“最原初的”，“第一重要的”意思

19世紀(jì)30年代中期以前，認(rèn)識(shí)其化學(xué)元素組成情況及原子之間結(jié)合比例，即確定經(jīng)驗(yàn)性的分子式

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1937年，A.W.k.Tiselius

建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳(electrophoresis)方法,于1948年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1941年，A.J.P.Martin和R.L.M.Synge建立了分配層析(partitionchromatography)技術(shù)，被授予1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

第3頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinChemistry1948"forhisresearchonelectrophoresisandadsorptionanalysis,especiallyforhisdiscoveriesconcerningthecomplexnatureoftheserumproteins"ArneW.K.TiseliusUppsalaUniversity

Uppsala,Sweden

1902-1971第4頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinChemistry1952"fortheirinventionofpartitionchromatography"ArcherJ.P.MartinRichardL.M.Synge

1/2oftheprize1/2oftheprizeNationalInstituteforMedicalResearchLondon,UnitedKingdom

RowettResearchInstituteBucksburn(Scotland),UnitedKingdom1910-20021914-1994第5頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

1953年，F(xiàn).Sanger利用紙層析和紙電泳技術(shù)第一次揭示出牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了以后數(shù)千種蛋白質(zhì)序列分析的先聲，被授予1958年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

第11頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinChemistry1958"forhisworkonthestructureofproteins,especiallythatofinsulin"FrederickSanger

UniversityofCambridge

Cambridge,UnitedKingdom

1918-第12頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBerg1/2oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USA1926-WalterGilbertFrederickSanger1/4oftheprize1/4oftheprize

HarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1932-1918-第13頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

J.C.Kendrew(1958)及M.F.Perutz(1960)利用X射線技術(shù)解析了肌紅蛋白(myoglobin)和血紅蛋白(hemoglobin)的三維結(jié)構(gòu)，使人們第一次能夠洞察生物大分子的空間結(jié)構(gòu)，共同贏得了1962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

第14頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinChemistry1962"fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteins"

MaxFerdinandPerutz1/2oftheprizeMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1914-2002JohnCowderyKendrew1/2oftheprizeMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1917-1997第15頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

20世紀(jì)70年代中后期，GunterBlobel利用體外蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞中很多分泌蛋白的跨膜方式，提出“信號(hào)假說”(signalhypothesis)，獲得了1998年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

第16頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

20世紀(jì)50年代后期，E.W.Sutherland發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)cAMP的存在，1971年被授予諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

70年代末80年代初，A.G.Gilman和M.Rodbell獨(dú)立發(fā)現(xiàn)G蛋白的存在，因此二人在1994年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”(signaltransduction)第17頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1994"fortheirdiscoveryofG-proteinsandtheroleoftheseproteinsinsignaltransductionincells"AlfredG.GilmanMartinRodbell1941-1925-1998UniversityofTexas,SouthwesternMedicalCenterDallas,TX,USANationalInstituteofEnvironmentalHealthSciencesResearchTrianglePark,NC,USA第18頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

60年代，P.Mitchell提出“化學(xué)滲透學(xué)說”，獲1978年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

70年代，P.D.Boyer提出“結(jié)合改變機(jī)制”；90年代，J.E.Walker測(cè)定ATP合酶的晶體結(jié)構(gòu)，他們共享了1997年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

揭示能量轉(zhuǎn)化機(jī)制第19頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmith1944-1932-2000LaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"第20頁,共39頁，2024年2月25日，星期天Nature1998;391:806-811.

Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.

第21頁,共39頁，2024年2月25日，星期天WhatRogerKornberghimselfhasnowdoneistodescribehowthegeneticinformationiscopiedfromDNAintowhatiscalledmessenger-RNA

第22頁,共39頁，2024年2月25日，星期天Kornberghaddescribedhowgeneticinformationistransferredfromamothercelltoitsdaughters.

第23頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007"fortheirdiscoveriesofprinciplesforintroducingspecificgenemodificationsinmicebytheuseofembryonicstemcells"MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies

USAUnitedKingdomUSA

UniversityofUtah

SaltLakeCity,UT,USA;HowardHughesMedicalInstitute

b.1937

(inItaly)

CardiffUniversity

Cardiff,UnitedKingdom

b.1941UniversityofNorthCarolinaatChapelHill

ChapelHill,NC,USAb.1925

(inUnitedKingdom)

第24頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinChemistry2008"forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFP"OsamuShimomuraMartinChalfieRogerY.Tsien

1/3oftheprize

1/3oftheprize

1/3oftheprizeUSAUSAUSAMarineBiologicalLaboratory(MBL)

WoodsHole,MA,USA;BostonUniversityMedicalSchool

Massachusetts,MA,USAb.1928

(inKyoto,Japan)ColumbiaUniversity

NewYork,NY,USAb.1947UniversityofCalifornia

SanDiego,CA,USA;HowardHughesMedicalInstituteb.1952

第25頁,共39頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2008"forhisdiscoveryofhumanpapillomavirusescausingcervicalcancer""fortheirdiscoveryofhumanimmunodeficiencyvirus"HaraldzurHausen

Fran?oiseBarré-Sinoussi

LucMontagnier

1/2oftheprize1/4oftheprize

1/4oftheprizeGermanyFranceFranceGermanCancerResearchCentre

Heidelberg,Germanyb.1936RegulationofRetroviralInfectionsUnit,VirologyDepartment,InstitutPasteurParis,Franceb.1947WorldFoundationforAIDSResearchandPreventionParis,Franceb.1932第26頁,共39頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)獎(jiǎng)：/nobel/chemistry/chemistry.html/nobel_prize/chemistry/

生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)：

/nobel/medicine/medicine.html/nobel_prizes/medicine/第27頁,共39頁，2024年2月25日，星期天Summary(1)

分離純化蛋白質(zhì)

測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)生物學(xué)活性分析探索結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第28頁,共39頁，2024年2月25日，星期天Summary(2)

學(xué)科交叉分子生物學(xué)是一門實(shí)踐性、應(yīng)用性強(qiáng)的學(xué)科

生化方法學(xué)是在不斷發(fā)展的

第29頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質(zhì)樣品的提取目的蛋白的獲取直接從生物體內(nèi)獲取基因工程表達(dá)重組蛋白采用免疫學(xué)方法獲取相關(guān)抗體獲取蛋白質(zhì)的編碼序列(cDNA)基因組測(cè)序基因組測(cè)序進(jìn)行推導(dǎo)獲取部分肽段氨基酸序列捕獲相應(yīng)蛋白質(zhì)第30頁,共39頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)典的細(xì)胞蛋白質(zhì)分離純化流程由下述主要步驟組成：清洗組織或細(xì)胞裂解細(xì)胞離心除去膜組分等獲得可溶性蛋白質(zhì)離心、層析、電泳等進(jìn)一步純化獲取產(chǎn)物蛋白第31頁,共39頁，2024年2月25日，星期天一、細(xì)胞的破碎各種組織和細(xì)胞的常用破碎方法細(xì)胞破碎方法組織種類

旋刀式勻漿大多數(shù)動(dòng)、植物組織手動(dòng)式勻漿柔軟的動(dòng)物組織高壓勻漿細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞研磨細(xì)菌、植物細(xì)胞高速珠磨細(xì)胞混懸液酶溶細(xì)菌、酵母去垢劑滲透組織培養(yǎng)細(xì)胞有機(jī)溶劑滲透細(xì)菌、酵母超聲破碎細(xì)胞混懸液低滲裂解紅細(xì)胞、細(xì)菌凍融裂解培養(yǎng)細(xì)胞

第32頁,共39頁，2024年2月25日，星期天二、去污劑處理溶解膜蛋白

去污劑為雙極性(amphipathic)脂類分子，可在水中溶解。通常由線性或帶有分枝的碳?xì)浠衔镂膊亢徒Y(jié)構(gòu)各不相同的親水性頭部組成SDSTritonX-100NP-40Tween