廢用對(duì)非冬眠和冬眠動(dòng)物骨骼肌肌纖維Ca-(2+)濃度及Bax和Bcl-2的影響

廢用對(duì)非冬眠和冬眠動(dòng)物骨骼肌肌纖維Ca~(2+)濃度及Bax和Bcl-2的影響研究背景：現(xiàn)階段對(duì)廢用性肌肉萎縮的研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌萎縮的直接原因是蛋白質(zhì)合成減少的同時(shí)其降解增多,其中以降解增多為主。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌在廢用期會(huì)造成胞漿Ca2+超載,繼而激活蛋白降解途徑。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn),胞漿Ca2+超載與細(xì)胞的凋亡途徑是密切相關(guān)的,其中Bax和Bcl-2分別是機(jī)體中重要的促凋亡基因和抑凋亡基因。研究目的：1.研究廢用對(duì)大鼠和達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)骨骼肌趾長(zhǎng)伸肌(ExtensorDigitorumLongus,EDL)肌纖維中Ca2+濃度變化的影響,川芎嗪對(duì)后肢去負(fù)荷大鼠EDL胞漿鈣的影響,并對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析冬眠黃鼠在冬眠期不活動(dòng)時(shí)肌肉不萎縮或較少萎縮的機(jī)制；2.研究廢用時(shí)期的大鼠和黃鼠,動(dòng)物體內(nèi)骨骼肌中凋亡相關(guān)因子Box和Bcl-2在基因和蛋白質(zhì)水平的相對(duì)表達(dá)量及其比值的變化情況,以期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與骨骼肌萎縮的關(guān)系,并從細(xì)胞凋亡的角度來分析黃鼠廢用時(shí)抗肌萎縮的可能機(jī)制。研究方法：1.后肢去負(fù)荷大鼠動(dòng)物模型的建立參考大鼠尾部懸吊法；2.用激光共聚焦法來測(cè)定活的EDL肌纖維中Ca2+的熒光強(qiáng)度,即活細(xì)胞中的相對(duì)Ca2+濃度；3.用實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)EDL和比目魚肌(Soleus,SOL)中凋亡相關(guān)因子Box和Bcl-2在基因水平的相對(duì)表達(dá)量；4.用WesternBlot實(shí)驗(yàn)來測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)EDL和SOL中凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2在蛋白質(zhì)水平的相對(duì)表達(dá)量。研究結(jié)果：1.大鼠在吊尾14d之后,其EDL肌纖維Ca2+濃度顯著升高了68.6%(P<0.05)；與吊尾組相比,大鼠灌藥組的EDL肌纖維中Ca2+濃度降低了46.2%(P<0.05)；2.與冬眠前組相比,黃鼠EDL肌纖維中Ca2+濃度在陣間激醒組升高了60.0%(P<0.05)；與冬眠中組相比,陣間激醒和出眠組分別升高了68.9%(P<0.05)和41.8%(P<0.05)；冬眠中組的Ca2+濃度與冬眠前黃鼠無差異；3.在基因表達(dá)水平,在骨骼肌(EDL和SOL)中,吊尾大鼠組的BaxlBcl-2比值相比較正常組來說分別升高了30.9%(P<0.05)和35.3%(P<0.05)；出眠組黃鼠的Bax/Bcl-2比值較冬眠前黃鼠分別下降了了28.3%(P<0.01)和17.7%(P<0.05)；4.在蛋白表達(dá)水平,在黃鼠骨骼肌(EDL和SOL)中,陣間激醒組中的Bax/Bcl-2比值較冬眠中組分別升高了82.5%(P<0.05)和26.9%(P<0.05),在SOL中,Bax/Bcl-2的比值在冬眠中組較冬眠前黃鼠降低了23.5%(P<0.05)。研究結(jié)論：1.大鼠在吊尾14天之后,其EDL肌纖維中Ca2+濃度顯著升高,這會(huì)使鈣蛋白酶Calpain轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上,進(jìn)一步啟動(dòng)并降解骨骼肌中細(xì)胞骨架蛋白,最終啟動(dòng)并降解了蛋白質(zhì),引起了骨骼肌萎縮；川芎嗪灌藥能顯著降低EDL肌纖維中Ca2+濃度,可能是由于川芎嗪與細(xì)胞膜上的L-型Ca2+通道結(jié)合后抑制其開放,阻止了Ca2+進(jìn)入胞漿從而緩解了鈣超載現(xiàn)象,這可能是川芎嗪應(yīng)對(duì)肌肉萎縮的機(jī)制。2.黃鼠骨骼肌肌纖維在冬眠中并未出現(xiàn)胞漿鈣超載現(xiàn)象,這與黃鼠骨骼肌不發(fā)生萎縮或少量萎縮相一致。但陣間激醒組黃鼠的EDL中肌纖維胞漿Ca2+濃度較冬眠前和冬眠中都高,說明胞漿鈣超載是一個(gè)有序的過程,當(dāng)胞漿中Ca2+濃度超過機(jī)體調(diào)節(jié)的閾值時(shí),會(huì)促使黃鼠主動(dòng)應(yīng)對(duì)這種不良的影響,即陣間激醒,出眠組與冬眠前組黃鼠并沒有顯著變化,說明黃鼠具有良好的調(diào)節(jié)能力,能更好的應(yīng)對(duì)鈣超載現(xiàn)象。3.基因水平：大鼠吊尾14天之后,骨骼肌(EDL和SOL)中Bax/Bcl-2的比值較正常組都有明顯的升高,這也說明廢用時(shí)大鼠骨骼肌發(fā)生了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,造成了肌萎縮。但灌藥組又恢復(fù)了正常水平,說明了川芎嗪可以降低由細(xì)胞凋亡途徑引起的肌肉萎縮；而黃鼠骨骼肌(EDL和SOL)中,出眠組Bax/Bcl-2的比值較冬眠前都有下降,說明出眠時(shí)黃鼠在基因水平的抑凋亡能力有所增強(qiáng)。4.在蛋白水平：黃鼠的骨骼肌(EDL和SOL)中,Bax/Bcl-2的比值在冬眠中不變或降低,這都說明了黃鼠可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而陣問激醒組較冬眠中都有升高,這說明在陣間激醒階段黃鼠有