幾丁質(zhì)脫乙?；竤erpentine和vermiform基因?qū)壋岚l(fā)育的影響

幾丁質(zhì)脫乙酰基酶serpentine和vermiform基因?qū)壋岚l(fā)育的影響果蠅是重要的模式生物之一,其發(fā)育歷程較為清晰明確,是研究發(fā)育過程中基因功能的理想模型,可為篩選新型農(nóng)藥靶基因提供良好的理論支撐。昆蟲多數(shù)為農(nóng)業(yè)害蟲,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮、消化道圍食膜及各種組織所特有的成分。多種酶參與了幾丁質(zhì)的合成和降解過程,其中幾丁質(zhì)脫乙?；福–DAs）在幾丁質(zhì)的修飾和裝配中起作用。CDAs基因促進(jìn)幾丁質(zhì)中與β-1,4糖苷鍵連接的N-乙?；咸前返囊阴０被撘阴；?形成不同程度的脫乙?；鶐锥≠|(zhì)（又稱殼聚糖）。由于人類和高等動(dòng)物沒有代謝幾丁質(zhì)的系統(tǒng),因此,將幾丁質(zhì)脫乙?；缸鳛檠邪l(fā)環(huán)境友好型殺蟲劑的靶基因具有較大的市場(chǎng)潛力。本研究以果蠅幾丁質(zhì)脫乙?；竤erpentine（serp）和vermiform（verm）基因?yàn)檠芯繉?duì)象,采用Gal4/UAS系統(tǒng),通過對(duì)果蠅不同組織部位進(jìn)行目的基因沉默,觀察果蠅發(fā)育情況的方法,對(duì)該基因在果蠅不同組織部位的作用進(jìn)行初步探索;其次,本研究選擇果蠅翅作為進(jìn)一步研究對(duì)象,探究了果蠅翅中該基因的來源及其功能。本文主要從以下三個(gè)內(nèi)容進(jìn)行研究:一、serpentine和vermiform基因?qū)壈l(fā)育的影響選取模式生物果蠅,采用Gal4/UAS系統(tǒng)在果蠅全身、表皮、氣管、咽側(cè)體、神經(jīng)、眼和翅中對(duì)serpentine（serp）和vermiform（verm）基因進(jìn)行干擾,觀察目的后代表型,探討果蠅幾丁質(zhì)脫乙?；冈诠壊煌M織部位中發(fā)揮的作用。研究結(jié)果表明降低果蠅全身、表皮和氣管中的serp和verm基因,均會(huì)導(dǎo)致果蠅死亡;而降低果蠅翅中serp和verm基因的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)果蠅并未致死,但果蠅翅出現(xiàn)缺陷;此外,在幾丁質(zhì)含量低的咽側(cè)體、神經(jīng)和眼中干擾serp和verm基因后,并未影響果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育。結(jié)果表明serp和verm基因主要在果蠅富含幾丁質(zhì)的部位發(fā)揮重要作用。二、在果蠅翅發(fā)育過程中serpentine和vermiform基因自主性作用在實(shí)驗(yàn)的前期研究中發(fā)現(xiàn)在翅上干擾serp和verm基因后,果蠅并未致死,但翅膀出現(xiàn)了畸形。Dong等研究表明serp由脂肪體合成轉(zhuǎn)運(yùn)至氣管,因此本章主要探討果蠅翅serp和verm基因的來源。采用UAS/Gal4系統(tǒng)在脂肪體中特異性干擾serp和verm基因后,用RT-qPCR的方法分別檢測(cè)脂肪體中serp和verm基因的沉默效率以及翅上serp和verm基因的表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾果蠅脂肪體上的serp和verm基因并不影響翅上該基因的表達(dá)量,所以serp和verm基因由果蠅翅細(xì)胞自主合成,而并不是先由脂肪體合成后再轉(zhuǎn)運(yùn)過來。三、果蠅翅發(fā)育中serpentine和vermiform基因的作用前人研究了serp和verm基因在果蠅氣管發(fā)育中的功能,指出二者的基因結(jié)構(gòu)相似且功能相近。但課題組前期研究發(fā)現(xiàn),分別干擾果蠅翅中serp和verm基因后,其成蟲翅出現(xiàn)不同表型。隨后選取翅上不同的Gal4驅(qū)動(dòng)不同翅區(qū)的serp或verm基因的表達(dá)下調(diào),發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的翅的畸形也不相同。在引入Gal80^ts溫控因子對(duì)serp和verm基因的干擾時(shí)間進(jìn)行調(diào)控后,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的共同點(diǎn)是持續(xù)干擾的時(shí)間越長(zhǎng),干擾效果越顯著,但是二者發(fā)揮作用的時(shí)期并不相同。鑒于前人發(fā)現(xiàn)serp和verm基因的功能主要是將幾丁質(zhì)脫乙?；笮纬擅撘阴３潭炔煌臍ぞ厶?并且能夠染色檢測(cè)其脫乙酰度,因此,本文在果蠅不同翅區(qū)干擾serp和verm基因后,用殼聚糖染色法觀察其脫乙酰度,發(fā)現(xiàn)干擾verm基因后,幾丁質(zhì)脫乙酰度與對(duì)照相比并未發(fā)生變化,而干擾serp基因后幾丁質(zhì)的脫乙酰度明顯降低。說明serp基因在幾丁質(zhì)脫去乙?；倪^程發(fā)揮重要作用。采用AFM微觀觀察翅膜表面納米級(jí)結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn),serp和verm基因?qū)Τ崮け砻娴募{米級(jí)“荷葉結(jié)構(gòu)”——突包的影響并不相同,serp基因的影響更為強(qiáng)烈。采用透射電子顯微鏡觀察翅脈幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn),干擾serp基因后并不影響