《GB-T核酸適體篩選制備標準操作規(guī)范》

ICS07.080

B20/39

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—2017

核酸適體篩選制備標準操作規(guī)范

Generaltechniquerulesforscreeningandpreparationofaptamer

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（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—2017

核酸適體篩選制備技術通則

1范圍

本標準規(guī)定了核酸適配體篩選條件與流程的優(yōu)化，建立高效、快速、標準化的篩選技術通則。

本標準適用于針對小分子、大分子、細胞、以及復雜靶標等不同層次靶標體系的核酸適配體篩選。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求

3術語和定義

3.1核酸適配體(Aptamer)

能夠與多種目標物（蛋白、藥物、金屬離子、無機或有機分子、細胞、組織）發(fā)生高親和性和特異

性結合的一類單鏈核苷酸（DNA或RNA）分子。

3.2指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,

SELEX)

利用大容量的隨機寡核苷酸文庫結合體外PCR擴增技術，通過寡核苷酸對相應靶標物質(zhì)的高親和性

和高特異性，在隨機序列文庫中，通過多次循環(huán)選擇富集，來獲取所需的特定結構或功能核酸適配體的

過程。

4操作步驟

4.1文庫的構建

4.1.1DNA文庫的構建

核酸適配體篩選的單鏈DNA文庫是由兩端的固定引物區(qū)加上中間的隨機區(qū)構成。固定引物區(qū)的設計

遵循一般PCR引物設計規(guī)則。中間隨機區(qū)的長度決定文庫的庫容量，通常為20-50堿基。初始文庫一般包

含1015～1018個隨機DNA序列。

4.1.2RNA文庫的構建

篩選RNA核酸適配體應先合成DNA文庫分子且序列5’端帶有T7啟動子識別序列，轉(zhuǎn)錄成RNA分子篩選

文庫。

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GB/TXXXXX—2017

4.2不同靶標的篩選

4.2.1細胞的篩選

細胞的篩選分為懸浮細胞和貼壁細胞篩選。懸浮細胞篩選應通過離心法；貼壁細胞篩選應在培養(yǎng)皿

或培養(yǎng)瓶中通過孵育清洗，吸棄上清保留細胞。

4.2.2大分子的篩選

大分子的篩選應將大分子偶聯(lián)到固相的載體上，分析固相載體的性質(zhì)，選擇磁性分離、離心分離和

超濾分離等。

4.2.3小分子的篩選

小分子的篩選應根據(jù)小分子靶標的自身結構特點和核酸適配體的應用目的，選擇固定靶標或固定核

酸庫的方法進行分離。

4.2.4復雜靶標的篩選

復雜靶標的篩選應根據(jù)復雜靶標的自身結構特點，選擇電泳分離、孵育清洗分離，要考慮消減或反

篩驗證方法，保證降低非特異性結合。

4.2.5結合效率的測定

在每一輪篩選的過程中應設立對應的結合效率檢測實驗，根據(jù)熒光定量PCR的Cq值計算出每一輪與

靶標結合的核酸分子數(shù)，與投入的總分子數(shù)比值，得到結合效率結果。

4.3擴增

4.3.1常規(guī)PCR擴增

將4.2得到的與靶標特異性結合的DNA進行PCR擴增，常見的PCR體系見表1。PCR擴增程序為：95℃預

變性5～10分鐘，95℃變性，55～60℃退火，72℃延伸，擴增35～40個循環(huán)。

表1常見的PCR體系

名稱終濃度

10×聚合酶buffer1×

dNTP0.2～0.5mM

正向引物0.025～0.5μM

反向引物0.025～0.5μM

DNA聚合酶0.02U/uL

熒光染料1～3×

模板小于總體積1/10

總體系（用水補足）20～100uL

4.3.2微滴式PCR擴增

微滴式PCR應按照4.3.1的PCR體系配置，進行微滴生成后應按照4.3.1的擴增程序進行，擴增得到的

DNA產(chǎn)物應通過正丁醇純化后制備單鏈。

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4.4次級文庫制備

DNA次級文庫的制備應采用磁珠法、酶解法、不對稱PCR法和長短鏈法中的一種或多種。RNA文庫的

制備應將PCR得到的雙鏈DNA為模板進行體外的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳回收。獲得

的單鏈產(chǎn)物后應采用分光光度計法測量A260/280，進行質(zhì)量及純度檢驗。

4.5多輪篩選和篩選進程監(jiān)測

將4.4獲得的靶標與文庫孵育，分離未結合的核酸，重復4.3-4.4過程10-20次。篩選過程中應逐輪

增加篩選壓力，方法主要包括：減少投入的單鏈DNA文庫的量、靶標的用量和兩者的孵育時間等。

4.5.1親和力檢測

在每輪篩選的同時應設立平行的結合效率檢測實驗。

4.5.2PCR擴增曲線的變化監(jiān)測庫容

PCR擴增曲線達到平臺期之后，應停止篩選并將該輪文庫的親和力。

4.6核酸適配體分析

4.6.1克隆測序

獲得具有親和力的篩選文庫應用未標記的引物擴增后進行克隆和測序。

4.6.2高通量測序

獲得具有親和力的篩選文庫應按照高通量測序要求準備后進行高通量測序并分析。

4.6.3核酸適配體序列結構分析

測序結果應利用分析生物學軟件進行核酸適配體的同源性分析和系統(tǒng)進化分析，并預測核酸適配體

的二級結構。

5防污染措施

檢測過程中防止交叉污染的措施按照G