Kallikrein-8促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化在糖尿病心臟和腎臟間質(zhì)纖維化中的作用及其機(jī)制研究

Kallikrein-8促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化在糖尿病心臟和腎臟間質(zhì)纖維化中的作用及其機(jī)制研究組織激肽釋放酶相關(guān)肽酶(tissuekallikrein-relatedpeptidases,KLKs)是一類具有胰蛋白酶和糜蛋白酶樣活性的絲氨酸蛋白酶家族,KLKs可特異性地裂解低分子量激肽原以形成激肽,后者通過選擇性地刺激緩激肽B1和B2受體進(jìn)而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用。本課題組前期研究指出KLK8上調(diào)誘導(dǎo)心肌肥厚以及進(jìn)展性心功能障礙,并且這一作用是依賴于EGF及PAR1/2信號(hào)通路而并非激肽受體信號(hào)通路。與此同時(shí),本課題組同樣發(fā)現(xiàn)KLK8上調(diào)誘導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化,并且內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂觸發(fā)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Endothelial-mesenchymaltransition,EndMT)參與KLK8上調(diào)介導(dǎo)的心肌間質(zhì)纖維化的發(fā)生。糖尿病是以長(zhǎng)期高血糖為主要特征,全身多器官系統(tǒng)病變的代謝紊亂綜合征;據(jù)統(tǒng)計(jì),2017年全球糖尿病患者人數(shù)高達(dá)4.35億;據(jù)估計(jì),至2045年,全球糖尿病患者人數(shù)將超過6億,糖尿病正逐漸成為全球性疾病。糖尿病如果不能夠及時(shí)診斷、治療將會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥,包括糖尿病心肌病、糖尿病腎病等,而后者以器官功能紊亂以及組織纖維化為主要特征。研究指出激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-kininsystem,KKS)參與糖尿病及其并發(fā)癥的病理發(fā)生發(fā)展,然而其中的機(jī)制尚未完全闡明,那么是否KLK8參與糖尿病心肌病以及糖尿病腎病器官功能紊亂以及組織纖維化的發(fā)生呢?因此,本研究在整體水平上采用1型糖尿病小鼠模型,細(xì)胞水平上高糖處理HCAECs以及HRGECs,擬首先觀察KLK8在內(nèi)皮細(xì)胞高糖處理時(shí)的表達(dá)改變,繼而利用KLK8轉(zhuǎn)基因和KLK8基因敲除兩種模式動(dòng)物、通過整體和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí)KLK8在糖尿病心肌以及腎臟組織EndMT和間質(zhì)纖維化病理發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用,并闡明其分子機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:第一部分KLK8促進(jìn)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化中的作用及其機(jī)制研究一.高糖顯著上調(diào)糖尿病小鼠心臟及冠脈內(nèi)皮細(xì)胞KLK8表達(dá)1.(1)腹腔注射STZ構(gòu)建1型糖尿病小鼠,構(gòu)建成功3/6個(gè)月后檢測(cè)心臟KLK8mRNA表達(dá),糖尿病組KLK8表達(dá)顯著高于對(duì)照組,并表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性;(2)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humancoronaryarteryendothelialcells,HCAECs)給與5.5mM、15mM、25mM葡萄糖處理120h,對(duì)照組給與mannitol處理;與對(duì)照組相比,高糖可顯著上調(diào)KLK8在mRNA水平表達(dá),并表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性;二.過表達(dá)KLK8誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT1.HCAECs給與KLK8腺病毒轉(zhuǎn)染72h以過表達(dá)KLK8,同空載體組相比,過表達(dá)KLK8可顯著增加間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSMA)與波形蛋白(vimentin)蛋白表達(dá),降低內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)和內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白(VE-cadherin)表達(dá),即誘導(dǎo)EndMT;(2)TGF-β1中和抗體部分阻斷過表達(dá)KLK8誘導(dǎo)的EndMT,即抑制KLK8誘導(dǎo)的αSMA與vimentin表達(dá)上調(diào)以及CD31與VE-cadherin表達(dá)下調(diào);二.KLK8上調(diào)參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、EndMT以及心臟纖維化應(yīng)用KLK8siRNA以敲低內(nèi)皮細(xì)胞KLK8表達(dá),對(duì)照組給與等量controlsiRNA;與對(duì)照組相比,KLK8siRNA可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,即內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物vWF,sTM以及E-selectin均顯著降低,內(nèi)皮細(xì)胞活力顯著升高,而單獨(dú)轉(zhuǎn)染KLK8siRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能無影響;此外,KLK8siRNA可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的VE-cadherin與CD31蛋白表達(dá)下調(diào)以及αSMA與vimentin蛋白上調(diào);三.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟組織纖維化以及心臟EndMT1.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟內(nèi)皮功能紊亂以及心臟功能紊亂;(1)小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)以構(gòu)建1型糖尿病小鼠,模型構(gòu)建成功后6個(gè)月檢測(cè)血糖水平,同野生型組相比,野生型糖尿病組血糖顯著增高,然而KLK8敲除糖尿病組小鼠血糖未見明顯降低;(2)同野生型對(duì)照組相比,糖尿病小鼠血清vWF,sTM,E-selectin均顯著升高,而KLK8缺失組糖尿病小鼠vWF,sTM,E-selectin較野生型組糖尿病小鼠顯著降低;2.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟EndMT;與野生型組相比,糖尿病小鼠心臟組織VE-cadherin和CD31表達(dá)顯著降低,αSMA和vimentin表達(dá)顯著升高,KLK8缺失可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物降低以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物增高,而單獨(dú)KLK8缺失小鼠心肌組織內(nèi)皮細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物未見明顯改變,免疫熒光雙染結(jié)果同樣顯示,同對(duì)照組相比,野生型糖尿病小鼠心臟CD31表達(dá)顯著降低而αSMA,vimentin與fsp1表達(dá)顯著增高,并且存在大量CD31與αSMA,vimentin以及fsp1共染,而KLK8缺失可顯著增加心臟CD31表達(dá)且αSMA,vimentin與fsp1表達(dá)顯著降低;3.KLK8缺失可顯著減輕糖尿病心臟組織纖維化及心臟功能紊亂;(1)同野生型對(duì)照組相比,6個(gè)月糖尿病小鼠血壓升高、心率降低、心臟收縮功能障礙,KLK8缺失可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的血壓升高、心率降低以及心臟收縮功能障礙,而單獨(dú)KLK8缺失小鼠血壓、心率、心功能未見明顯異常;(2)Masson染色結(jié)果顯示,KLK8缺失同樣可顯著降低糖尿病心臟組織纖維化;四.KLK8降解VE-cadherin,進(jìn)而促進(jìn)γ-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位1.KLK8過表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及EndMT并非通過激肽B1或B2受體,而是通過其酶的活性(1)應(yīng)用B1RsiRNA與B2RsiRNA以下調(diào)激肽B1和B2受體表達(dá),MTT結(jié)果顯示,B1RsiRNA與B2RsiRNA并不能阻斷KLK8腺病毒引起的內(nèi)皮細(xì)胞活力降低,不僅如此,B1RsiRNA與B2RsiRNA同樣不能阻斷KLK8上調(diào)引起的EndMT;(2)應(yīng)用兩種蛋白酶的抑制劑:antipain與硫酸鋅以阻斷KLK8的蛋白水解作用,同對(duì)照組相比,antipain及硫酸鋅可部分阻斷KLK8誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷以及EndMT,即增加內(nèi)皮細(xì)胞活力,上調(diào)VE-cadherin和CD31蛋白表達(dá),降低αSMA和vimentin蛋白表達(dá);2.KLK8降解VE-cadherin繼而引發(fā)γ-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位(1)Westernblot結(jié)合N-末端測(cè)序KLK8可剪切VE-cadherin形成一個(gè)約30kDa細(xì)胞外片段;(2)腺病毒載體處理的內(nèi)皮細(xì)胞γ-catenin位于細(xì)胞膜并且部分與VE-cadherin共定位,而KLK8腺病毒處理組細(xì)胞膜γ-catenin與VE-cadherin量顯著減少,并且細(xì)胞核內(nèi)存在大量γ-catenin表達(dá);不僅如此,同腺病毒載體相比,KLK8導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞胞膜及胞漿中γ-catenin表達(dá)降低而細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)量顯著升高,而轉(zhuǎn)染VE-cadherin慢病毒可逆轉(zhuǎn)KLK8誘導(dǎo)的γ-catenin核轉(zhuǎn)位以及胞膜和胞漿γ-catenin表達(dá)量;五.γ-catenin參與介導(dǎo)KLK8誘導(dǎo)EndMT,而這一作用是通過與p53相互作用完成1.γ-catenin參與介導(dǎo)KLK8誘導(dǎo)EndMT應(yīng)用γ-cateninsiRNA以下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞γ-catenin表達(dá),γ-cateninsiRNA可顯著逆轉(zhuǎn)KLK8誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin與CD31表達(dá)降低以及αSMA與vimentin的表達(dá)升高;2.γ-catenin參與介導(dǎo)KLK8誘導(dǎo)EndMT的作用是通過與p53相互作用完成(1)Co-IP結(jié)果顯示,γ-catenin在內(nèi)皮細(xì)胞中與p53和TCF4相互聯(lián)系,且KLK8過表達(dá)可進(jìn)一步加強(qiáng)γ-catenin與p53和TCF4間的結(jié)合作用;(2)p53抑制劑pifithrin-α可逆轉(zhuǎn)KLK8誘導(dǎo)的EndMT,然而,TCF/β-catenin通路抑制劑ICG-001不能逆轉(zhuǎn)KLK8介導(dǎo)的EndMT;3.TGF-β1參與介導(dǎo)KLK8誘導(dǎo)的EndMT和心臟組織纖維化(1)KLK8可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1在mRNA的表達(dá),這一作用可以被γ-cateninsiRNA以及pifithrin-α部分逆轉(zhuǎn),然而,ICG-001不能逆轉(zhuǎn)KLK8對(duì)TGF-β1的mRNA表達(dá);(2)CHIP結(jié)果表明HIF-1α可結(jié)合到TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)的缺氧反應(yīng)元件,而KLK8可進(jìn)一步增強(qiáng)這一結(jié)合作用,HIF-1α的抑制劑echinomycin不僅能夠抑制TGF-β1的基礎(chǔ)表達(dá),而且能夠阻斷KLKL8誘導(dǎo)的TGF-β1在內(nèi)皮細(xì)胞mRNA水平的表達(dá),γ-cateninsiRNA與pifithrin-α可顯著逆轉(zhuǎn)KLK8誘導(dǎo)的HIF-1α與TGF-β1的結(jié)合作用;4.p53-Smad3通路參與介導(dǎo)KLK8誘導(dǎo)的EndMT以及心臟組織纖維化(1)KLK8過表達(dá)可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞p53與Smad3的結(jié)合作用,而這一作用可被γ-cateninsiRNA部分阻斷;(2)KLK8過表達(dá)可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因包括Snail,Slug,Twist,Zeb1,Zeb2在mRNA水平的表達(dá),然而γ-cateninsiRNA與pifithrin-α可顯著逆轉(zhuǎn)KLK8誘導(dǎo)的促纖維化轉(zhuǎn)錄因子表達(dá);六、高葡萄糖促進(jìn)γ-catenin依賴性的p53與HIF-1α和Smad3相互作用,繼而以KLK8依賴性的方式增加TGF-β1/Smad3促纖維化靶基因表達(dá)1.KLK8參與高葡萄糖誘導(dǎo)的γ-catenin核轉(zhuǎn)位及TGF-β1依賴性促纖維化通路激活(1)高葡萄糖處理導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞胞膜及胞漿中γ-catenin表達(dá)顯著降低,細(xì)胞核中γ-catenin表達(dá)明顯升高,然而KLK8siRNA可降低細(xì)胞核且增加胞膜和胞漿中γ-catenin含量;(2)高葡萄糖處理導(dǎo)致TGF-β1mRNA表達(dá)及釋放顯著增加,與此同時(shí)TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因mRNA表達(dá)同樣明顯增加,然而KLK8siRNA與γ-cateninsiRNA可以很大程度上逆轉(zhuǎn)高葡萄糖所誘導(dǎo)的TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因表達(dá)。2.KLK8參與介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的γ-catenin依賴性p53與Smad3、HIF-1α的相互作用(1)高葡萄糖可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞γ-catenin與p53間聯(lián)系明顯加強(qiáng),然而KLK8siRNA可顯著逆轉(zhuǎn)γ-catenin與p53間相互聯(lián)系。不僅如此,KLK8siRNA與γ-cateninsiRNA同樣能夠逆轉(zhuǎn)高葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞p53與HIF-1α和Smad3間的相互作用。CHIP結(jié)果顯示:高葡萄糖能夠進(jìn)一步加強(qiáng)HIF-1α與TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件的結(jié)合作用,然而KLK8siRNA,γ-cateninsiRNA及p53抑制劑可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的HIF-1α與TGF-β1啟動(dòng)子的結(jié)合作用;(2)在整體水平上,我們發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠在24周時(shí)心臟TGF-β1mRNA與蛋白水平及TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因表達(dá)均顯著增加,而KLK8缺失可顯著逆轉(zhuǎn)糖尿病心臟TGF-β1mRNA與蛋白水平及TGF-β1/Smad3通路促纖維化靶基因表達(dá)的增加;(3)KLK8缺失可顯著逆轉(zhuǎn)糖尿病心臟γ-catenin與p53間相互聯(lián)系,KLK8缺失同樣可以逆轉(zhuǎn)糖尿病心臟p53與HIF-1α和Smad3間的相互作用。整體水平的CHIP結(jié)果顯示,同野生型組相比,KLK8缺失可顯著逆轉(zhuǎn)HIF-1α與TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用。結(jié)論:高糖促進(jìn)心肌組織KLK8表達(dá),進(jìn)而通過誘導(dǎo)心臟內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂觸發(fā)的EndMT導(dǎo)致心臟間質(zhì)纖維化、心臟功能紊亂,而這一作用是依賴于KLK8作用于VE-cadherin-γ-catenin復(fù)合體,VE-cadherin被降解,γ-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而激活TGF-β信號(hào)通路來完成。第二部分KLK8促進(jìn)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在糖尿病腎病腎臟間質(zhì)纖維化中的作用及其機(jī)制研究一.轉(zhuǎn)基因KLK8大鼠腎臟組織發(fā)生EndMT以及纖維化1.KLK8過表達(dá)導(dǎo)致腎臟組織纖維化和腎臟損傷Masson染色結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因KLK8大鼠腎臟組織較之同齡野生型相比出現(xiàn)明顯的膠原堆積,并且表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性,即12周齡轉(zhuǎn)基因KLK8大鼠腎臟組織膠原堆積明顯多于6周齡;并且腎臟組織中羥脯氨酸和膠原蛋白及TGF-β1水平較對(duì)照組明顯升高;尿蛋白檢測(cè)結(jié)果同樣顯示轉(zhuǎn)基因KLK8大鼠較之同齡野生型相比尿蛋白含量明顯增加,并且均表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性;2.KLK8過表達(dá)導(dǎo)致腎臟組織發(fā)生EndMT同野生型大鼠相比,轉(zhuǎn)基因KLK8大鼠腎臟組織vimentin和α-SMA表達(dá)顯著增加,而VE-cadherin和CD31表達(dá)顯著降低;進(jìn)一步免疫熒光雙染技術(shù)結(jié)果表明:較之同齡野生型大鼠相比,12周齡轉(zhuǎn)基因KLK8大鼠腎臟組織內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31表達(dá)顯著降低,而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、fsp1顯著增多,并且存在大量與CD31共染的陽(yáng)性細(xì)胞,共聚焦結(jié)果同樣證實(shí)轉(zhuǎn)基因KLK8大鼠腎臟組織CD31與α-SMA、fsp1存在共定位;3.過表達(dá)KLK8導(dǎo)致人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂KLK8腺病毒轉(zhuǎn)染人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(Humanglomerularendothelialcells,HRGECs)以過表達(dá)KLK8,KLK8可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活力顯著下降,并表現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴性,不僅如此,內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物E-selectin,sTM,vWF的釋放量明顯增加,并且內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增加;4.過表達(dá)KLK8誘導(dǎo)HRGECs發(fā)生EndMTKLK8可劑量依賴性地增加αSMA與vimentin蛋白表達(dá),降低CD31與VE-cadherin表達(dá);二.KLK8上調(diào)參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、En