生殖毒性試驗(yàn)流程及意義及生殖道微生態(tài)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

嚙齒類(lèi)動(dòng)物生殖毒性I、II、III段實(shí)驗(yàn)流程及意義1.概述生殖毒性試驗(yàn)（Reproductivetoxicitystudy）是通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)反映受試物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖功能和發(fā)育過(guò)程的影響，預(yù)測(cè)其可能產(chǎn)生的對(duì)生殖細(xì)胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等親代生殖機(jī)能的不良影響，以及對(duì)子代胚胎-胎兒發(fā)育、出生后發(fā)育的不良影響。包括：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)（I段）、胚胎—胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（II段）、圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)（III段）。生殖毒性試驗(yàn)中，為方便實(shí)驗(yàn)一般可將一個(gè)完整生命周期過(guò)程分成以下幾個(gè)階段如下圖所示：圖1.動(dòng)物生命周期劃分A.從交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育和成熟、交配行為、受精）。B.從受孕到著床（成年雌性生殖功能、著床前發(fā)育、著床）。C.從著床到硬腭閉合（成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、主要器官形成）。D.從硬腭閉合到妊娠終止（成年雌性生殖功能、胎仔發(fā)育和生長(zhǎng)、器官發(fā)育和生長(zhǎng)）。E.從出生到離乳（成年雌性生殖功能、幼仔對(duì)宮外生活的適應(yīng)性、離乳前發(fā)育和生長(zhǎng)）。F.從離乳到性成熟（離乳后發(fā)育和生長(zhǎng)、獨(dú)立生活的適應(yīng)能力、達(dá)到性成熟的情況）。各段試驗(yàn)研究階段如下：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)（I段）：A-B胚胎—胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（II段）：C-D圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)（III段）：C-F1一般試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)介1.1受試物生殖毒性試驗(yàn)的受試物應(yīng)能充分代表臨床研究受試物或上市藥品。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首選嚙齒類(lèi)動(dòng)物為大鼠。在胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中，一般還需要采用第二種哺乳動(dòng)物，家兔為優(yōu)先選用的非嚙齒類(lèi)動(dòng)物。1.3給藥1.3.1計(jì)量選擇：至少應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組，必要時(shí)可增加劑量組。高劑量：應(yīng)出現(xiàn)一些輕微的母體毒性反應(yīng)，或?yàn)樽畲蠼o藥量/最大耐受量。低劑量：應(yīng)為生殖毒性方面的“未觀察到不良反應(yīng)的劑量（NOAEL）”。1.3.2給藥途徑：給藥途徑應(yīng)與臨床擬用途徑一致（不用腹腔注射途徑，因腹腔注射會(huì)對(duì)胎兒及子宮產(chǎn)生直接影響）。1.4對(duì)照組應(yīng)設(shè)賦形劑對(duì)照組。當(dāng)賦形劑可能產(chǎn)生作用或影響受試物的作用時(shí)，應(yīng)另設(shè)空白對(duì)照組。二、生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（I段）生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)是對(duì)雌雄動(dòng)物由交配前到交配期直至胚胎著床給藥，以評(píng)價(jià)受試物對(duì)動(dòng)物生殖的毒性或干擾作用（生殖細(xì)胞接觸藥物后對(duì)受胎能力、生殖系統(tǒng)及子代有無(wú)不良影響）。評(píng)價(jià)內(nèi)容包括配子成熟度、交配行為、生育力、胚胎著床前階段和著床等。研究階段包括生命周期的A階段和B階段如下圖所示：圖2.生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)研究階段示意圖*注*：引自《生殖毒性發(fā)育試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施中應(yīng)該注意的問(wèn)題》，作者：常艷1.試驗(yàn)流程如下圖所示：圖3.生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)流程圖2.試驗(yàn)流程圖解：2.1分組及飼養(yǎng)：首先雌鼠、雄鼠分別按體重隨機(jī)分為給藥組和對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，每天觀察并記錄動(dòng)物體征和死亡情況；2.2給藥期：雄鼠：交配前給藥4-10周，給藥期持續(xù)整個(gè)交配期，至處死；雌鼠：交配前兩周開(kāi)始給藥，并持續(xù)至胚胎著床（GD6-GD7）；2.3陰道涂片檢查：合籠交配前2周須每天對(duì)雌鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，觀測(cè)每只雌鼠的性周期變化，以檢查其是否對(duì)交配和交配前時(shí)間有影響；2.4合籠：雌鼠、雄鼠1：1合籠交配，交配期2周。交配結(jié)束后雌鼠、雄鼠分別進(jìn)行不同處理：雄鼠：交配成功后即可處死，并進(jìn)行剖檢，保存睪丸、附睪、異常組織器官；檢測(cè)項(xiàng)目主要包括：附睪精子計(jì)數(shù)、精子活力檢查、精子畸形檢查；統(tǒng)計(jì)項(xiàng)目：攝食量、體重、生育率；雌鼠：未交配成功的雌鼠：交配結(jié)束后處死；交配成功孕鼠：每天觀察并記錄體征、死亡情況；每3天測(cè)定體重、攝食量；并于GD13-GD15日處死，進(jìn)行剖檢。保存子宮、卵巢及異常組織器官；檢測(cè)項(xiàng)目：計(jì)數(shù)黃體數(shù)、活胎、死胎、吸收胎數(shù)，并計(jì)算著床數(shù)；統(tǒng)計(jì)項(xiàng)目：攝食量、體重、受孕率、妊娠率、著床前丟失率、著床后丟失率；三、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（II段）胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)是研究妊娠動(dòng)物自胚胎著床至硬腭閉合給藥，評(píng)價(jià)藥物對(duì)妊娠動(dòng)物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括大鼠和家兔。評(píng)價(jià)內(nèi)容包括妊娠動(dòng)物較非妊娠雌性動(dòng)物增強(qiáng)的毒性、胚胎-胎仔死亡、生長(zhǎng)改變和結(jié)構(gòu)變化等。研究階段主要包括生命周期的C階段至D階段如下圖所示：圖4.胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)研究階段示意圖*注*：引自《生殖毒性發(fā)育試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施中應(yīng)該注意的問(wèn)題》，作者：常艷試驗(yàn)流程如下圖所示：圖5.胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)流程圖實(shí)驗(yàn)流程圖解：2.1制備孕鼠/孕兔，并按體重平均分為給藥組和對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，每3天測(cè)定攝食量、體重；每天觀察并記錄體征、死亡情況；2.1給藥期：給藥期設(shè)定在懷孕動(dòng)物胚胎著床至硬腭閉合期。孕鼠給藥期：GD6-GD15；孕兔給藥期：GD6-GD18；2.3剖檢：動(dòng)物飼養(yǎng)至分娩前處死，剖腹取仔。孕鼠剖檢日期：GD20/GD21；家兔剖檢日期：GD28/GD29；母鼠/母兔：進(jìn)行大體尸檢觀察胎盤(pán)是否異常；保存異常組織器官；計(jì)數(shù)：黃體數(shù)、活胎、死胎、吸收胎；計(jì)算：攝食量、體重、著床數(shù)；胎仔：胎仔清洗干凈后分別測(cè)定每只胎仔體重、頂臀長(zhǎng)，并進(jìn)行大體外觀檢查。該過(guò)程以后胎鼠與胎兔處理是有區(qū)別的。胎鼠：50%胎仔制作骨骼標(biāo)本，進(jìn)行骨骼檢查；50%胎仔制作內(nèi)臟標(biāo)本，進(jìn)行內(nèi)臟檢查；胎兔：全部胎兔首先進(jìn)行剖檢，進(jìn)行內(nèi)臟檢查，然后將剖檢后胎兔剝離皮膚組織，并剔除脂肪，全部制作成骨骼標(biāo)本，進(jìn)行后期骨骼檢查。四、圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)（III段）圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)是檢測(cè)從胚胎著床到幼仔離乳給藥對(duì)妊娠/哺乳的雌性動(dòng)物以及胚胎和子代發(fā)育的不良影響；評(píng)價(jià)內(nèi)容包括妊娠動(dòng)物較非妊娠雌性動(dòng)物增強(qiáng)的毒性、出生前和出生后子代死亡情況、生長(zhǎng)發(fā)育的改變以及子代的功能缺陷，包括F1代的行為、性成熟和生殖功能。研究階段包括生命周期中的C階段至F階段如下圖所示：圖6.圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)研究階段示意圖*注*：引自《生殖毒性發(fā)育試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施中應(yīng)該注意的問(wèn)題》，作者：常艷1.試驗(yàn)流程如下圖所示：圖7.圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)流程圖2.試驗(yàn)流程圖解：2.1制備孕鼠，按體重平均分為給藥組和對(duì)照組，飼養(yǎng)至分娩，該階段為懷孕期，每天對(duì)孕鼠進(jìn)行體征及死亡情況觀察；每3天進(jìn)行體重、攝食量測(cè)定；2.1給藥期：設(shè)定在胚胎硬腭閉合至哺乳結(jié)束期，一般為孕鼠懷孕15日至子鼠離乳（GD15-PND21）進(jìn)行給藥。2.3分娩：孕鼠一般于GD21-GD23分娩；在大鼠分娩結(jié)束后進(jìn)行觀察（不能打擾其分娩，以免產(chǎn)生食仔現(xiàn)象），計(jì)數(shù)死胎數(shù)、活胎數(shù)、雌胎仔數(shù)和雄胎仔數(shù)；計(jì)算F1代大鼠畸形率、成活率、性別比例；對(duì)胎鼠進(jìn)行外觀畸形檢查，并分別測(cè)定每窩雌、雄胎仔總體重；后進(jìn)入哺乳階段。2.3哺乳期：P代大鼠：每天進(jìn)行體征及死亡情況觀察；每3天進(jìn)行體重、攝食量測(cè)定，飼養(yǎng)至離乳；F1代胎鼠：每天計(jì)數(shù)雌、雄胎鼠數(shù)量；每3天分別測(cè)定雌、雄胎鼠總體重；于PND4進(jìn)行窩仔數(shù)調(diào)整（減少由于每窩胎仔數(shù)目不同而產(chǎn)生的對(duì)胎鼠身體發(fā)育等指標(biāo)的影響）；哺乳期至離乳后還需根據(jù)身體發(fā)育、反射發(fā)育等檢測(cè)指標(biāo)日程安排對(duì)F1代胎鼠進(jìn)行身體發(fā)育檢測(cè)和反射發(fā)育檢測(cè)；2.4離乳：F1代大鼠于PND21離乳，代表哺乳期結(jié)束。此時(shí)對(duì)P代雌鼠及F1代大鼠分別進(jìn)行相應(yīng)處理：P代大鼠：哺乳期結(jié)束后（PND21）進(jìn)行大體剖檢；保存:異常組織器官；統(tǒng)計(jì)攝食量、體重、哺乳成活率；F1代大鼠：每窩留存雌、雄仔鼠各1只，數(shù)量不夠時(shí)同劑量組仔鼠補(bǔ)齊，飼養(yǎng)至性成熟。該階段每天觀察并記錄F1代大鼠體征、死亡情況；每周測(cè)定攝食量、體重；據(jù)F1代仔鼠行為指標(biāo)檢測(cè)日程安排進(jìn)行轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和穿梭箱試驗(yàn)。F1代大鼠合籠交配：F1代大鼠性成熟后同劑量組雌鼠與雄鼠1:1配對(duì)，合籠交配，交配期為2周。交配結(jié)束后對(duì)雄鼠、雌鼠分別進(jìn)行相應(yīng)處理：F1代雄鼠：處死，計(jì)算生育率；未孕雌鼠：處死，并進(jìn)行大體剖檢，保存異常組織器官；孕鼠：飼養(yǎng)至胚胎硬腭閉合（GD13-GD15），懷孕期每天觀察并記錄F1代孕鼠體征、死亡情況，每3天測(cè)定攝食量、體重；2.6F1代雌鼠于GD13-GD15處死，大體尸檢，檢查有無(wú)胎盤(pán)異常，保存異常組織器官；計(jì)數(shù)黃體數(shù)、活胎、死胎、吸收胎數(shù)；計(jì)算攝食量、體重、妊娠率；活胎率、死胎率、著床前丟失率、著床后丟失率；生殖道微生態(tài)學(xué)生殖道微生態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)菌群密集度：++~+++菌群多樣性：++~+++乳酸桿菌比例：≥70％其他雜菌比例：≤30％當(dāng)陰道菌群的密集度為II—III、多樣性為II—III、優(yōu)勢(shì)菌為乳酸桿菌，清潔度為I度、乳酸桿菌功能正常、陰道ph<4.5時(shí)，定義為陰道微生態(tài)正常。當(dāng)密集度、多樣性、優(yōu)勢(shì)菌、炎性反應(yīng)、ph和乳酸桿菌功能任何一項(xiàng)出現(xiàn)異常，都可診斷為微生態(tài)失調(diào)。菌群密集度的量化標(biāo)準(zhǔn)：+：每油鏡視野下平均細(xì)菌數(shù)1-9個(gè)；++：每油鏡視野下平均細(xì)菌數(shù)10-99個(gè)；+++：每油鏡視野下平均細(xì)菌數(shù)100個(gè)以上；++++：油鏡下觀察細(xì)菌聚集成團(tuán)，或密集覆蓋粘膜上皮細(xì)胞。菌群多樣性的量化標(biāo)準(zhǔn)：+：每油鏡視野下能辨別1-3種細(xì)菌；++：每油鏡視野下能辨別4-6種細(xì)菌；+++：每油鏡視野下能辨別7-9種細(xì)菌；++++：每油鏡視野下能辨別10種以上細(xì)菌。LBG分級(jí)：LBGI級(jí)：許多多形性乳酸桿菌，沒(méi)有或只有很少的其他的細(xì)菌;LBGIIa級(jí)：混合菌群，但主要為乳酸桿菌；LBGIIb級(jí)：混合菌群，但乳酸桿菌比例明顯減少，少于其它菌群；LBGIII級(jí):乳酸桿菌嚴(yán)重減少或缺失，其它細(xì)菌過(guò)度增長(zhǎng)。Nugent評(píng)分：評(píng)分方法：革蘭染色，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，用半定量評(píng)估法對(duì)乳酸桿菌、加德納菌和普雷沃菌、動(dòng)彎桿菌進(jìn)行評(píng)分。以上4種細(xì)菌形態(tài)分值之和為總分值。.評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：評(píng)分乳酸桿菌加德納菌和普雷沃菌動(dòng)彎桿菌0++++--1+++++或++2+++++++或++++3++++4-++++注：-；未見(jiàn)細(xì)菌；+少于1個(gè)細(xì)菌；++：1-4個(gè)細(xì)菌；5-30個(gè)細(xì)菌；++++：30個(gè)以上細(xì)菌；診斷標(biāo)準(zhǔn)BV:Nugent評(píng)分≧7分BV中介：Nugent評(píng)分4-6分正常：Nugent評(píng)分0-3分。AV評(píng)分：評(píng)分方法：AV評(píng)分包括LBG分級(jí)、白細(xì)胞數(shù)、含中毒顆粒的白細(xì)胞比例、背景菌落、基底旁上皮細(xì)胞所占比例五個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)的品跟可分為正?；蜉p度(0分），中度（1分）和重度（2分），各指標(biāo)得分相加為AV總得分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：AV評(píng)分LBG分級(jí)白細(xì)胞數(shù)含中毒顆粒的白細(xì)胞背景菌落PBC比例0I和IIa≦10/HPF無(wú)或散在不明顯或溶胞性無(wú)或﹤1%1IIb>10/HPF或≦10/上皮細(xì)胞≦50％的白細(xì)胞G—小桿菌≦10%2III＞10/上皮細(xì)胞>50%的白細(xì)胞G*球菌或鏈球菌≧10%診斷標(biāo)準(zhǔn)：AV評(píng)分﹤3分；無(wú)AV體征