SN2552.10-2010乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法第10部分：阪崎腸桿菌檢驗(yàn)免疫熒光方法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法第10部分：阪崎腸桿菌檢驗(yàn)免疫熒光方法Microbiologicalexaminationformilkandmilkproductshygiene-Part10:DetectionofEmterobacter2010-05-27發(fā)布SN/T2552.10-2010SN/T2552《乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法》分為十三個(gè)部分 ----第2部分：檢驗(yàn)樣品的制備與稀釋；-第3部分：酵母、霉菌菌落計(jì)數(shù)； ----第7部分：陰溝腸桿菌檢驗(yàn)；第8部分：普通變形桿菌和奇異變形桿菌檢驗(yàn)： 第10部分：阪崎腸桿菌檢驗(yàn)免疫熒光法 第11部分：蠟樣芽孢桿菌的分離與計(jì)數(shù)； 第12部分：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)與計(jì)數(shù)； 第13部分：假單孢菌屬的分離與計(jì)數(shù)。本部分是SN/T2552的第10部分。本部分按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本部分由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本部分起草單位：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局。SN/T2552.10—2010乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法第10部分：阪崎腸桿菌檢驗(yàn)免疫熒光方法1范圍SN/T2552的本部分規(guī)定了乳粉中阪崎腸桿菌的免疫熒光檢驗(yàn)方法。本部分適用于乳粉中阪崎腸桿菌的快速篩選，乳制品可參照使用。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T1632.1奶粉中阪崎腸桿菌檢驗(yàn)方法第1部分：分離與計(jì)數(shù)SN/T2552.1乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法第1部分：取樣指南3溶液與試劑3.1PBS緩沖液：見附錄A第A.3章。3.3pH9.0碳酸鹽-甘油緩沖溶液：見附錄A第A.5章。3.4阪崎腸桿菌多克隆抗體或單克隆抗體試劑及異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光抗體選用商品化的以阪崎腸桿菌單克降抗體和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠Fab熒光抗體，染色時(shí)應(yīng)按照試劑標(biāo)明的常規(guī)染色工作濃度和稀釋方法進(jìn)行稀釋后使用。注1:所用熒光抗體應(yīng)在有效期以內(nèi)。注2:已稀釋的熒光抗體試劑置4℃儲(chǔ)存可使用1個(gè)月左右，保持其固有的染色亮度不變，如發(fā)現(xiàn)其染色亮度下降，則不能繼續(xù)使用。4設(shè)備與材料76mm×26mm,厚度0.8mm～1.0mm,事先刻好編號(hào)及八個(gè)小方格，自左至右排列，每行四格，上下共兩行(或采用供免疫熒光技術(shù)專用的多凹涂膜截玻片),用洗滌劑徹底清洗油污，擦洗干凈，并經(jīng)滴水檢查證實(shí)無油污后，再浸于95%乙醇中保存?zhèn)溆谩?.2蓋玻片22mm×22mm,厚度0.13mm～0.17mm,按同上方法進(jìn)行去油污處理。4.3熒光顯微鏡具有投射光或落射光光源裝置，配裝能投射波長(zhǎng)為330nm～350nm的激發(fā)濾片與接受波長(zhǎng)大于400nm的阻斷濾片。1瞬2抽樣和制樣按SN/T2552.1執(zhí)行：無菌稱取樣品100g至2L的樣品稀釋瓶中，加入900mL預(yù)熱到45℃的滅菌蒸餾水，或者將樣品直接稱量到裝有9倍于樣品質(zhì)量，并已預(yù)熱到45℃的滅菌蒸餾水的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻.36℃一!℃培養(yǎng)18h～22h。5.2.1染色步驟參見附錄B。以直徑3mm的接種環(huán)經(jīng)培養(yǎng)的增菌液一環(huán)，制成較薄的標(biāo)本涂片，置37℃恒溫箱(或室溫)充分晾干后，用無水乙醇一氧甲烷-甲醛固定液固定5min～10min,再用95%乙醇浸洗后晾干(此項(xiàng)乙醇重復(fù)使用以不超過三次為宜)。5.2.2將阪崎腸桿菌多克隆抗體或單克隆抗體試劑按染色工作濃度滴加于各標(biāo)本涂片上，放濕盒內(nèi)，置37℃30min后取出，用0.01molLpH9.0PBS沖去多余的抗體，另?yè)Q相同PBS浸洗10min,再以蒸餾水沖洗后晾干。5.2.3將羊抗小鼠熒光抗體試劑按染色工作濃度滴加于各標(biāo)本涂片上，放濕盒內(nèi)，置37℃30min后取出，用0.01mol/LpH9.0PBS沖去多余的熒光抗體，另?yè)Q相同PBS浸洗10min,再以蒸餾水沖洗后晾干。5.2.4滴加pH9.0碳酸鹽-甘油緩沖溶液后.加蓋玻片封片。注1:對(duì)所用熒光抗體之染色工作濃度，必要時(shí)可用已知標(biāo)準(zhǔn)菌種重新測(cè)定。注2:每次涂片檢查時(shí)皆應(yīng)用1至數(shù)個(gè)已知染色陽性菌種作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。6鏡檢及結(jié)果報(bào)告6.1鏡檢菌體熒光染色亮度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如下：6.2結(jié)果判定6.2.1每個(gè)樣品制備2個(gè)～3個(gè)涂片，鏡檢觀察時(shí)應(yīng)結(jié)合發(fā)熒光菌體的形態(tài)與菌量綜合判定。6.2.2陽性及可疑陽性結(jié)果：菌體熒光亮度達(dá)到2一左右，菌體形態(tài)特征基本符合阪崎腸桿菌短桿狀形態(tài)，且多數(shù)視野中均能檢出數(shù)個(gè)菌體以上。由于抗體與細(xì)菌的結(jié)合有可能是多價(jià)的，觀察時(shí)菌體形態(tài)可能呈現(xiàn)出團(tuán)塊狀，應(yīng)結(jié)合普通光和熒光下菌體形態(tài)位置的比較進(jìn)行判斷。6.2.3陰性結(jié)果：熒光亮度在2+以下(不包括?-),且不屬于可疑陽性結(jié)果范圍者，均為陰性。6.3報(bào)告方法6.3.2熒光染色鏡檢為陽性或可疑陽性結(jié)果：按SNT1632.1繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)法檢查，并根據(jù)培養(yǎng)法檢查結(jié)果做報(bào)告。3(規(guī)菟性附錄)培養(yǎng)基和試劑蛋白胨葡萄糖磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀牛膽鹽煌綠蒸餾水應(yīng)使用純凈的牛膽鹽和煌綠，減少對(duì)受損傷且數(shù)量極少的腸桿菌的生長(zhǎng)抑制。將各成分加入蒸餾至7.2±0.1,分裝適宜容器。115℃高壓滅菌15min,制成的培養(yǎng)基為綠色，可放置2℃~8℃冷藏柜保存，4周內(nèi)使用牛心浸汁朊蛋白胨磷酸氫二鈉蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，緩緩加熱至溶解，分裝5mL于16mm×150mm試管中，121℃高壓滅菌15min,最終pH7.4±0.2。0.01mol/LpH9.0磷酸鹽-生理鹽水緩沖溶液，溶解無水磷酸氫二鈉1.42g,氯化鈉8.5g于1000mL蒸餾水中，使完全溶解，用酸度計(jì)測(cè)定其pH值9.0以上即可，必要時(shí)可用1mol/L氫氧化鈉調(diào)整至pH9.1左右。按順序?qū)o水乙醇60mL、三氯甲烷(CHCl)30mL混勻，再加入36%～38%甲醛10mL,混勻溶解無水碳酸鈉6g,無水碳酸氫鈉37g于蒸餾水中，加至1000mL,使完全溶解，混勻，即成pH9.2碳酸鹽緩沖液。以上項(xiàng)緩沖液1份加甘油9份混勻即成。注1:所用甘油應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)純品或分析純品。注2:配成后置4℃儲(chǔ)存，在儲(chǔ)存期間其pH值逐漸下降，應(yīng)以每2周左右重新配制一次為宜。和心的和心的(資料性附錄)間接法免疫熒光染色步驟示意圖標(biāo)本(增菌液)涂片(用直徑3mm的接種環(huán))晾干K氏固定液固定(5min~10min)95%乙醇浸洗晾干加阪崎腸桿菌特異性單克隆抗體放濕盒內(nèi)37℃3