SN1869-2007食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法PCR法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法PCR法Rapiddetectionmethodsforpathogensinfoods—PCRmethod2007-04-06發(fā)布2007-10-16實(shí)施I本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A是規(guī)范性附錄，附錄B、附錄C和附錄D是資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局、中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)、大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所、中華人民共和國(guó)青島出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局、深圳太太基因工程有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用普通PCR技術(shù)快速檢測(cè)食品中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的方法；用BAX@全自動(dòng)致病菌PCR檢測(cè)系統(tǒng)'檢測(cè)食品中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7和阪崎腸桿菌的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的檢驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T4789.4食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)GB/T4789.5食品微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)CB/T4789.6食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)GB/T4789.7食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)GB/T4789.8食品微生物學(xué)檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)GB/T4789.9食品微生物學(xué)檢驗(yàn)空腸彎曲菌檢驗(yàn)GB/T4789.10食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)GB/T4789.30食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN0170出口食品中沙門氏菌檢驗(yàn)方法SN0172出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法SN0173出口食品副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法SN0174出口食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)方法SN0175出口食品中空腸彎曲菌檢驗(yàn)方法SN0184出口食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法SN/T0973進(jìn)出口肉及肉制品中腸出血性大腸桿菌O157:H7檢驗(yàn)方法SN/T1022出口食品中霍亂弧菌檢驗(yàn)方法WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用ISO6579微生物學(xué)——沙門氏菌檢驗(yàn)方法指南ISO11290-1食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)——單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性和定量檢測(cè)方法第11)為美國(guó)杜邦公司(DuPontQualicon)的產(chǎn)品。2ISO16654食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)—大腸桿菌O157檢測(cè)方法NMKLNo.156北歐食品協(xié)會(huì)食品中致病性弧菌定性和定量檢測(cè)方法FDA/BAMChapter5美國(guó)食品藥品管理局微生物學(xué)分析手冊(cè)第2章沙門氏菌FDA/BAMChapter9美國(guó)食品藥品管理局微生物學(xué)分析手冊(cè)第9章弧菌FDA/BAMChapter10美國(guó)食品藥品管理局微生物學(xué)分析手冊(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性和定量檢測(cè)方法USDA/FSISMLG4C.01美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)局生肉、畜胴體擦拭樣品、整雞淋洗液、即食食品、禽肉制品和巴氏蛋制品中沙門氏菌BAX-PCR篩選方法USDA/PSISMLG8A.01美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)局單核細(xì)胞增生李斯特氏菌BAX篩選方法下列縮略語(yǔ)適合于本標(biāo)準(zhǔn)。PCRpolymerasechainreactiondNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate脫氧核苷三磷酸。dATPdeoxyadenosinetriphosphate脫氧腺苷三磷酸。dGTPdeoxyguanosinetriphosphate脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸。dCTPdeoxycytidinetriphosphate脫氧胞苷三磷酸。dTTPdeoxythymidinetriphosphate脫氧胸苷三磷酸。dUTPdeoxyuridinetriphosphate脫氧尿苷三磷酸。十二烷基硫酸鈉。Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三(羥甲基)氨基甲烷。DEPC焦碳酸乙二酯。3TaqDNA聚合酶。uracilDNAglycosylase尿嘧啶DNA-糖基酶。4生物安全措施為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測(cè)沙門氏菌，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)小心處置。并按GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5防污染措施參照標(biāo)準(zhǔn)《臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用》(WS/T230)中第6章污染的預(yù)防和控制。6試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均采用分析純。6.310×PCR緩沖液[其中氯化鉀(KCI):500mmol/L;Tris-HCl(pH8.3):100mmol/L;明膠：0.1%]。6.5瓊脂糖。6.610×上樣緩沖液：含0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。6.750×TAE緩沖液：稱取484gTris,量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA(pH:8.0),溶于水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。6.8DNA分子量標(biāo)記物(100bp～1000bp)。6.9Eppendorf管和PCR反應(yīng)管。6.12常見(jiàn)致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌)普通PCR檢測(cè)試劑盒2(試劑盒組成、功能及使用注意事項(xiàng)參見(jiàn)附錄B)。6.13BAX@沙門氏菌的PCR檢測(cè)試劑盒(Qualicon#17710608,試劑盒組成參見(jiàn)附錄C),5℃±3℃放置。6.14BAX@單核細(xì)胞增生李斯特氏菌PCR檢測(cè)試劑盒(Qualicon#17710609),5℃±3℃放置。6.15BAX@彎曲菌的PCR檢測(cè)試劑盒(Qualicon#17720680),5℃±3℃放置。6.16BAX@系統(tǒng)腸出血性大腸桿菌O157:H7多重(MP)PCR篩選試劑盒(Qualicon#17720673)。6.17BAX@系統(tǒng)腸出血性大腸桿菌O157:H7(MP)PCR快速檢測(cè)增菌培養(yǎng)基(Qualicon#2)由指定單位提供，給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具46.18BAX@阪崎腸桿菌的PCR檢測(cè)試劑盒(Qualicon#17720657),5℃±3℃放置。7儀器和設(shè)備7.2電泳裝置。7.3凝膠分析成像系統(tǒng)。7.4PCR超凈工作臺(tái)。7.5高速臺(tái)式離心機(jī)(離心轉(zhuǎn)速12000r/min以上),臺(tái)式離心機(jī)(離心轉(zhuǎn)速2000r/min)。7.7BAX@全自動(dòng)致病菌檢測(cè)系統(tǒng)(啟動(dòng)包)。第一法普通PCR法8檢測(cè)程序普通PCR方法檢測(cè)程序見(jiàn)圖1。樣品制備選擇性增菌肉湯或待鑒定的菌株細(xì)菌DNA的提取PCR擴(kuò)增電泳和結(jié)果觀察陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果傳統(tǒng)的方法確認(rèn)圖1PCR檢測(cè)致病菌程序圖9操作步驟9.1樣品制備、增菌培養(yǎng)和分離9.1.1沙門氏菌按照GB/T4789.4或SN0170或ISO6579或FDA/BAMChapter5或USDA/FSISMLG4C.01方法進(jìn)行。9.1.2志賀氏菌按照GB/T4789.5方法進(jìn)行。9.1.3金黃色葡萄球菌可按照GB/T4789.10或SN0172方法進(jìn)行。9.1.4小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可按照GB/T4789.8或SN0174方法。59.1.5單核細(xì)胞增生李斯特氏菌可按照GB/T4789.30或SN0184或ISO11290或FDA/BAMChapter10或USDA/FSISMLG8A.01方法進(jìn)行。9.1.6空腸彎曲菌按照GB/T4789.9或SN0175方法進(jìn)行。9.1.7腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7按照GB/T4789.6或SN/T0973或ISO16654方法進(jìn)行。9.1.8副溶血性弧菌按照GB/T4789.7或SNO173或FDA/BAMChapter9或NMKLNo.156方法進(jìn)行。9.1.9霍亂弧菌按照SN/T1022或FDA/BAMChapter9或NMKLNo.156方法進(jìn)行。9.1.10創(chuàng)傷弧菌按照FDA/BAMChapter9或NMKLNo.156方法進(jìn)行。9.2細(xì)菌模板DNA的提取9.2.1直接提取法對(duì)于上述方法培養(yǎng)的增菌液，可直接取該增菌液1mL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，8000r/min離心5min,盡量吸棄上清；加入50μLDNA提取液(參見(jiàn)附錄B),混勻后沸水浴5min,12000r/min離心5min,取上清保存于一20℃?zhèn)溆靡源龣z測(cè)?！?0℃可長(zhǎng)期保存。對(duì)于9.1方法分離到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入50μLDNA提取液，再按照上述步驟制備模板DNA以待檢測(cè)。9.2.2有機(jī)溶劑提純法取待測(cè)樣本(增菌培養(yǎng)液或分離菌落菌懸液)1mL,加到1.5mL離心管中，8000r/min離心4min,盡量吸棄上清；加入750μLDNA提取液，沸水浴5mi加酚：三氯甲烷(1:1,體積比)700μL,振蕩混勻，13000r/min離心5min,去上清液，70%乙醇沖洗一次，13000r/min離心5min,沉淀溶于20μL核酸溶解液中。保存在—20℃?zhèn)溆谩?70℃可長(zhǎng)期保存。也可使用等效的商業(yè)化的DNA提取試劑盒并按其說(shuō)明提取制備模板DNA。9.3PCR擴(kuò)增9.3.1引物的序列引物的序列見(jiàn)附錄A。9.3.2空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置空白對(duì)照設(shè)為以水代替DNA模板；陰性對(duì)照采用非目標(biāo)菌的DNA作為PCR反應(yīng)的模板；陽(yáng)性對(duì)照采用含有檢測(cè)序列的DNA(或質(zhì)粒)作為PCR反應(yīng)的模板。9.3.3PCR反應(yīng)體系普通PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。試劑貯備液濃度25μL反應(yīng)體系中加樣體積/μL10×PCR緩沖液氯化鎂(MgCl?)25mmol/LdNTP.(含dUTP)各2.5mmol/LUNG酶0.06上游引物20pmol/μl.下游引物Taq酶5U/μL雙蒸水—補(bǔ)至25注1:反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。注2:每個(gè)反應(yīng)體系應(yīng)設(shè)置兩個(gè)平行反應(yīng)。6PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)附錄A。9.3.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.8%～2%瓊脂糖凝膠(55℃~60℃時(shí)加入溴化乙錠至終濃度為0.5pg/mL,也可在電泳后進(jìn)行染色)。取8μL～15μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別和2μL上樣緩沖液混合，進(jìn)行點(diǎn)樣，用DNA分子量標(biāo)記物做參照。3V/cm～5V/cm恒壓電泳，電泳20min～40min,電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。10結(jié)果判定和報(bào)告在陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶條件下，如待測(cè)樣品未出現(xiàn)相應(yīng)大小的擴(kuò)增條帶，則可報(bào)告該樣品檢驗(yàn)結(jié)果為陰性；如待測(cè)樣品出現(xiàn)相應(yīng)大小擴(kuò)增條帶則可判定該樣品結(jié)果為假定陽(yáng)性，則回到傳統(tǒng)的檢測(cè)步驟，進(jìn)一步應(yīng)按9.1中該致病菌對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)，最終結(jié)果以后者的檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。如果陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶和/(或)陽(yáng)性對(duì)照未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，本次待測(cè)樣品的結(jié)果無(wú)效，第二法BAX@全自動(dòng)致病菌PCR檢測(cè)方法11適用范圍BAX@全自動(dòng)致病菌PCR檢測(cè)方法，包括食品中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7和阪崎腸桿菌的檢測(cè)方法。BAX全自動(dòng)致病菌檢測(cè)系統(tǒng)是應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)食品中的致病菌的自動(dòng)方法。擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始，BAX@系統(tǒng)PCR片劑中的熒光染料就會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合，光照時(shí)發(fā)出熒光信號(hào)。陽(yáng)性或陰性結(jié)果。13.1沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7檢測(cè)程序參見(jiàn)圖1(沒(méi)有電泳步驟)。13.2BAX阪崎腸桿菌PCR方法檢測(cè)程序見(jiàn)圖2。14操作步驟14.1樣品增菌14.1.1沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌的樣品制備、增菌培養(yǎng)和分離見(jiàn)9.1。14.1.2腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7增菌方法按照BAX@系統(tǒng)O157:H7增菌培養(yǎng)基用戶指14.1.3阪崎腸桿菌增菌：以無(wú)菌操作稱取25g樣品，放入裝有225mLmLST-Vm肉湯中，混勻，在45℃±0.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20h～22h;取10μL上述增菌液加入500μL的BHI肉湯中，36℃±1℃培養(yǎng)3h。714.2細(xì)菌模板DNA的制備沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7和阪崎腸桿菌增菌肉湯或菌落的細(xì)菌模板DNA的制備按各自BAX⑩系統(tǒng)篩選的PCR分析試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。14.3BAX系統(tǒng)致病菌的檢測(cè)按照BAX@用戶指導(dǎo)書(shū)來(lái)準(zhǔn)備試劑，進(jìn)行檢測(cè)和讀取結(jié)果。25g樣品+225mLmLST-VmBAX系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果ml.ST-Vm增菌液取黃色菌落做確認(rèn)試驗(yàn)15結(jié)果說(shuō)明15.1BAX@檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品可以出具陰性報(bào)告。15.2檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性的樣品需要繼續(xù)按照傳統(tǒng)的方法進(jìn)行確認(rèn)。15.3檢測(cè)結(jié)果顯示為不確定或錯(cuò)誤時(shí)，用BAX@系統(tǒng)重新進(jìn)行檢測(cè)。CC(規(guī)范性附錄)PCR檢測(cè)的靶基因、引物序列和反應(yīng)參數(shù)表A.1PCR檢測(cè)的靶基因、引物序列和反應(yīng)參數(shù)表致病菌靶基因名稱引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度預(yù)變性擴(kuò)增循環(huán)數(shù)后延伸沙門氏菌5’-gtgaaattatcgccacgttcgggcaa-3’志賀氏菌5'-gccggtcagccaccctetgagagtac-3’金黃色葡萄球菌5’-aaaaaagcacataacaagcg-3’5’-gataaagaagaaaccagcag-3’小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌5'-aataccgcataacgtcttcg-3’單增李斯特氏菌5’-gatacagaaacateggttggc-3’空腸彎曲桿菌5’-gaatgaaattttagaatgggg-3’致病菌靶基因名稱引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度預(yù)變性擴(kuò)增后延伸腸出血性大腸埃希氏菌5’-cgagtacattggcatcgtg-3’副溶血性弧菌5'-aaageggattatgcagaagcactg-3’霍亂弧菌創(chuàng)傷弧菌5'-ccgcggtacaggttggcgca-3’5'-cgccacccactttegggec-3’注：PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因的擴(kuò)增儀型號(hào)的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。o(資料性附錄)致病菌普通PCR檢測(cè)試劑盒B.1試劑盒組成每個(gè)試劑盒(每個(gè)反應(yīng)體系體積為25μL)成分見(jiàn)表B.1。表B.1試劑盒成分組成成分PCR反應(yīng)液Taq酶UNG酶陽(yáng)性對(duì)照1ml1管陰性對(duì)照1mL1管B.2說(shuō)明B.2.1PCR反應(yīng)液中含有特異性引物及各種離子。B.2.2核酸溶解液是去離子水，用于溶解核酸。B.3使用注意事項(xiàng)B.3.1嚴(yán)格執(zhí)行行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范。B.3.2本試劑盒僅用于體外檢測(cè)，操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，開(kāi)始檢測(cè)前要仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)全文。B.3.3試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后要稍事離心。反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免泄露污染儀器。(資料性附錄)BAX