3.2基因工程的基本操作程序（第1課時）

第三章基因工程第2節(jié)第1課時目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構(gòu)建（課前+課中+課后，三案一體）課前案【預(yù)習(xí)新知】一、目的基因的篩選與獲取1.目的基因的概念在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因就是目的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要指編碼蛋白質(zhì)的基因。2.篩選合適的目的基因從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。3.利用PCR獲取和擴增目的基因（1）PCR的含義：聚合酶鏈式反應(yīng)的縮寫，是一項根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。（2）條件：引物、DNA模板、耐高溫的DNA聚合酶、4種脫氧核苷酸等。（3）擴增過程：目的基因DNA受熱變性后分解為單鏈，引物與單鏈結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下延伸，即將4種脫氧核苷酸加入到引物的3’端，如此循環(huán)多次。每次循環(huán)一般可分為變性、復(fù)性和延伸三步。二、基因表達載體的構(gòu)建1.目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，并使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2.基因表達載體的構(gòu)建過程3.基因表達載體的組成及作用【預(yù)習(xí)自測】1.Taq酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。（X）2.PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上的堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高。（√）3.PCR技術(shù)擴增目的基因時需用解旋酶將DNA雙鏈打開。（X）第1課時目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構(gòu)建課中案【導(dǎo)】1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎?培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟?【思】1.基因工程的基本操作程序主要包括那幾個步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？【議】1.基因工程操作過程中，哪些步驟中具有堿基互補配對現(xiàn)象？基因工程操作過程中第一、二、四步中均有堿基互補配對現(xiàn)象，而只有第三步?jīng)]有。2.基因工程過程中的關(guān)鍵是什么？基因工程第二步基因表達載體的構(gòu)建。3.PCR技術(shù)的原理是什么？DNA半保留復(fù)制。4.PCR反應(yīng)過程過程說明圖解變性當(dāng)溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸72℃左右時，耐高溫的DNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5’端向3’端延伸【展】學(xué)生展示討論結(jié)果【評】對比PCR與DNA復(fù)制過程PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原則堿基互補配對原料四種脫氧核苷酸條件模板、酶、能量不同點解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化場所體外復(fù)制細胞內(nèi)（主要在細胞核內(nèi)）酶耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶結(jié)果大量的DNA片段形成整個DNA分子【檢】引導(dǎo)學(xué)生總結(jié)本節(jié)課內(nèi)容【練】完成課后案第1課時目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構(gòu)建課后案1．下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性內(nèi)切核酸酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是（

）A．①②③④ B．①②④③C．①④②③ D．①④③②【答案】C【分析】分析圖解：圖①中雙鏈DNA分子切成兩段，中間出現(xiàn)了黏性末端，圖②中兩個具有平末端的DNA片段連接成一個完整的DNA分子，圖③中DNA分子的雙鏈解開，圖④是以解開的單鏈DNA作為模板形成子鏈的過程?！驹斀狻緼BCD、限制性核酸內(nèi)切酶用于切割DNA片段，故①用的是限制性核酸內(nèi)切酶；DNA聚合酶用于DNA的復(fù)制過程，將單個的脫氧核糖核苷酸連接起來，形成脫氧核糖核苷酸鏈，故④用的是DNA聚合酶；DNA連接酶用于連接DNA片段，故②用的是DNA連接酶；解旋酶會使DNA雙鏈解旋而分開，故③用的是解旋酶，C正確，ABD錯誤。故選C。2．科學(xué)家常用PCR特異性地快速擴增目的基因，PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖液中進行，需要提供DNA母鏈、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶和2種引物。下列相關(guān)敘述錯誤的是（

）A．DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板B．4種脫氧核苷酸：合成DNA子鏈的原料C．耐高溫的DNA聚合酶：打開DNA雙鏈并延伸DNA子鏈D．2種引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸【答案】C【分析】PCR原理：在高溫作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的，實際上就是在體外模擬細胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程?！驹斀狻緼B、PCR技術(shù)是一項體外擴增DNA的技術(shù)，該過程中需要用DNA母鏈作為復(fù)制的模板，需要4種脫氧核苷酸作為復(fù)制的原料，AB正確；C、PCR技術(shù)中，DNA雙鏈是在高溫條件下解旋的，耐高溫的DNA聚合酶用于催化子鏈的延伸，C錯誤；D、PCR技術(shù)中需要一對引物，作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸，D正確。故選C。3．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟，是成功的關(guān)鍵，下列相關(guān)說法不正確的是（）A．構(gòu)建基因表達載體的目的包括使目的基因在受體細胞中能穩(wěn)定存在且遺傳給下一代B．基因工程中使用的標記基因有許多種，有的標記基因是質(zhì)粒上固有的C．一個基因表達載體一般包括目的基因、標記基因、起始密碼和終止密碼等結(jié)構(gòu)D．基因表達載體中的復(fù)制原點是質(zhì)粒DNA的復(fù)制的起點【答案】C【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：1、目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。2、基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。3、將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛毎钣行У姆椒ㄊ秋@微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛毎姆椒ㄊ歉惺軕B(tài)細胞法。4、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交技術(shù)。（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。【詳解】A、基因表達載體的構(gòu)建的目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用，A正確；B、質(zhì)粒上的標記基因有的是固有的，也可以是人為加上去的，B正確；C、一個基因表達載體一般包括目的基因、標記基因、啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)，C錯誤；D、因表達載體中的復(fù)制原點是質(zhì)粒DNA的復(fù)制的起點，沒有復(fù)制遠點，質(zhì)粒DNA就不能復(fù)制，D正確。故選C。4．將外源基因送入細胞通常是利用質(zhì)粒作為載體。下列有關(guān)質(zhì)粒的敘述，正確的是（）A．質(zhì)粒從細胞中提取出來后即可以直接使用，無須人工改造B．質(zhì)粒上常有特殊的標記基因，以便于重組DNA分子的篩選C．質(zhì)粒是具有自我復(fù)制能力的DNA分子，只存在于原核生物中D．質(zhì)粒一般只有一個限制酶切制位點，以便于目的基因插入【答案】B【分析】作為運載體必須具備的條件：①能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存；②具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入；③具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來?！驹斀狻緼、天然的質(zhì)粒不能直接作為載體，基因工程中用到的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的，A錯誤；B、載體上需要具有某些標記基因，以便于重組DNA分子的篩選，常見的標記基因有抗生素抗性基因等，B正確；C、質(zhì)粒不只存在于原核生物中，如酵母菌中也含有質(zhì)粒，C錯誤；D、質(zhì)粒一般有一至多個限制酶的切割位點，以便于目的基因插入，D錯誤。故選B。5．科研人員以抗四環(huán)素基因為標記基因，通過基因工程的方法讓大腸桿菌生產(chǎn)鼠的β珠蛋白，治療鼠的鐮刀型細胞貧血癥。下列相關(guān)實驗設(shè)計，不合理的是（）A．用β珠蛋白基因、啟動子、終止子、抗四環(huán)素基因等元件來構(gòu)建基因表達載體B．利用正常小鼠DNA分子通過PCR克隆出β珠蛋白基因的編碼序列C．用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經(jīng)導(dǎo)入β珠蛋白編碼序列的大腸桿菌D．將β珠蛋白基因表達載體導(dǎo)入具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中【答案】D【分析】基因表達載體包括啟動子、目的基因（β珠蛋白基因）、標記基因（抗四環(huán)素基因）、終止子等。抗四環(huán)素基因是標記基因，用于篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細胞，因此受體細胞（大腸桿菌）不含有四環(huán)素抗性基因。導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗四環(huán)素，因此可以用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出已經(jīng)導(dǎo)入β珠蛋白編碼序列的大腸桿菌?！驹?/p>