基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1在大鼠心肌梗死模型中的時(shí)空表達(dá)研究

續(xù)表2-2蛋白免疫印跡檢測(cè)試劑試劑品牌30%Acr-Bis(29:1)Beyotime（中國(guó)上海）四甲基乙二胺（TEMED）Phygene（中國(guó)福建）封閉液Applygen（中國(guó)北京）2.1.4酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑表2-3酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑大鼠基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1/CXCL12)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(Elabscience)ELISA酶標(biāo)板凍干標(biāo)準(zhǔn)品濃縮生物素化抗體(100×)濃縮HRP酶結(jié)合物（100×）標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液生物素化抗體稀釋液酶結(jié)合物稀釋液濃縮洗滌液(25×)底物溶液(TMB)反應(yīng)終止液封板覆膜2.1.5實(shí)驗(yàn)儀器表2-4實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器品牌酶標(biāo)儀TECAN（瑞士）伯樂(lè)MP全能型成像系統(tǒng)Bio-radChemDocMP（美國(guó)）低溫高速離心機(jī)Eppendorf（德國(guó)）離心機(jī)Scilogex(美國(guó))SDS電泳裝置Bio-Rad(美國(guó))轉(zhuǎn)膜儀Invitrogen(美國(guó))熒光定量PCR儀Eppendorf(德國(guó))水平搖床QILINBEIER（美國(guó)）續(xù)表2-4實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器品牌超低溫冰箱海爾（中國(guó)青島）4℃冰箱海爾（中國(guó)青島）恒溫金屬浴Miulab（中國(guó)杭州）漩渦混合器Scilogex(美國(guó))微量天平Sartorius(德國(guó))移液器Eppendorf(德國(guó))冷凍研磨儀凈信（中國(guó)上海）動(dòng)物呼吸機(jī)奧爾科特（中國(guó)上海）2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1左冠狀動(dòng)脈降支結(jié)扎術(shù)制備大鼠心肌梗死模型大鼠每100g體重腹腔注射300μL戊巴比妥鈉溶液，等待5min麻藥發(fā)揮作用后，綁好四肢與上齒，剃去左側(cè)胸部與脖頸處毛發(fā)，用碘伏擦拭剪刀、鑷子、以及切口部位以消毒。右手執(zhí)剪刀，左手執(zhí)鑷子縱向剪開(kāi)頸部氣管處皮膚。然后左手持彎嘴鑷，右手持直鑷，沿肌肉紋理縱向撕開(kāi)表層肌肉，找到較粗的氣管，用小剪刀剪開(kāi)一個(gè)小口，插入呼吸機(jī)并運(yùn)行，隨后在左胸第3/4肋骨中間間隙，橫向剪開(kāi)皮膚-表層肌肉-胸腔膜以及撕開(kāi)心臟外膜，找到冠狀動(dòng)脈左前降支（在左心耳左下方）用縫合針縫合扎緊，隨后從內(nèi)到外依次縫合，每層縫合3針，縫合完畢后取出呼吸機(jī)針頭，用鑷子撐開(kāi)頸處皮膚以防堵塞氣管，按壓心臟以幫助大鼠恢復(fù)自我呼吸，打耳號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，令其傾斜躺在籠子中等待麻藥失效。大鼠心肌梗死手術(shù)后分別飼養(yǎng)0.5天、1天、2天、3天、5天和7天后進(jìn)行取材：以300μL/100g給大鼠注射水合氯醛溶液，等待5分鐘麻藥發(fā)揮作用后，放平，左手持彎嘴鑷，右手持剪刀，依次剪開(kāi)大鼠腹部皮膚、表層肌肉、胸膜腔，向心臟注射0.5mL氯化鉀溶液處死大鼠，取出大鼠心臟放入水中清洗以洗去心臟中的血液，分別選取大鼠心臟中的心肌梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)和正常區(qū)的組織，放入離心管-20℃短期或-80℃長(zhǎng)期保存。2.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SDF-1基因的水平變化提取RNA：從冰箱取出樣品，取適量樣品放入EP研磨管中，加入Trizol浸沒(méi)樣品，用冷凍研磨機(jī)使得樣品（10s）粉碎，轉(zhuǎn)移至RNase-freeEP管中，離心，棄去上清液，沉淀中加入1毫升Trizol和200微升氯仿，混勻，靜置15分鐘；離心，在EP管中加入1.25微升糖原，將離心后的上清收集400微升放入此EP管，隨后加入400微升異丙醇，用移液槍吹打使以上三種組分混勻；離心，棄去上清液，EP管中加入75%乙醇混勻。離心，吸走上清液，室溫放置使得乙醇揮發(fā)。加入無(wú)核酶的水溶解核酸，使用NanoDrop檢測(cè)RNA濃度OD值（A260/280=1.8-2.0）標(biāo)記，放入負(fù)八十?dāng)z氏度冰箱中保存。反轉(zhuǎn)錄：使用TAKARAPrimeScriptRTMasterMix(PerfetRealTime)試劑盒（RR036A）,程序設(shè)置：37℃發(fā)生反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15分鐘，85℃反轉(zhuǎn)錄的酶失活反應(yīng)，最后4℃。構(gòu)建如下體系：組分體積5×PrimeScriptRTMasterMix4μLRNA1μLRNase-freeWater20μL-V（RNA）Total20μL使用TAKARATBGreen@FastQpcrMix試劑盒（RR430A）進(jìn)行熒光定量PCR：將下列各種組分按照如下的體積加入到8聯(lián)排熒光定量PCR管中，引物的合成信息見(jiàn)表2-5,將熒光定量PCR管置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。組分體積2×TBGreenMix10μLcDNA1μLRNase-freeWater7μLPrimer-F1μLPrimer-R1μLTotal20μL表2-5引物序列信息基因方向序列（5’-3’）SDF1-ratForwardTGTGCATTGACCCGAAATTAReverseTCCTCAGGGGTCTACTGGAAGAPDH-ratForwardGACAACTTTGGCATCGTGGAReverseATGCAGGGATGATGTTCTGG2.2.3蛋白免疫印跡檢測(cè)SDF-1蛋白水平的變化樣本的收集與裂解：精密稱(chēng)量心臟組織，放入玻璃研磨器中，加入裂解液，研磨，將液體放入新的EP管中，冰水條件下裂解，30分鐘后離心，取上清液。蛋白濃度的測(cè)定：5mg/mLBSA（牛血清白蛋白）標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水稀釋濃度至0.5mg/mL。分別加入標(biāo)準(zhǔn)品0、1、2、4、8、12、16、20微升至九十六孔板中，加去離子水到總體積20為衛(wèi)生，使得BSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、25、50、100、200、300、400、500μg/μL。將適量體積樣品和去離子水加入到九十六孔板中，使得樣品和去離子水總體積為20微升。將G250染色液加入各孔中，五分鐘后，測(cè)定A595的吸光度。制備電泳樣品：制好的樣本中加入適量5×SDS蛋白上樣緩沖液，提前預(yù)熱金屬浴至100℃，樣品放于100℃金屬浴上加熱5分鐘來(lái)制備電泳樣本。制膠：將兩張干凈的玻璃板放在夾中，隨后卡在架子上。在玻璃板中注滿(mǎn)水并進(jìn)行驗(yàn)漏，確認(rèn)密閉性良好后，將水倒掉，為灌膠做準(zhǔn)備。按照表2-6配置分離膠。在50mL離心管中放入表2-6中各組分，使用移液槍吹打離心管中的組分以混勻，將膠水灌到向玻璃板中，灌膠完畢后，加入異丙醇進(jìn)行液封，待固化后，將其倒掉。配置濃縮膠。在50mL離心管中加入表2-7中各組分并混勻，用濃縮膠填滿(mǎn)在玻璃板剩余空間，插入梳子，待固化后，即得。表2-6SDS分離膠（15%）配膠表組分名稱(chēng)取樣量H2O4.830%Acr-Bis(29:1)10.0濃縮膠緩沖液(pH8.8)5.010%APS0.2TEMED0.008表2-7SDS濃縮膠（5%）配膠表組分名稱(chēng)取樣量H2O3.4430%Acr-Bis(29:1)1.0濃縮膠緩沖液(pH6.8)1.510%APS0.06TEMED0.006SDS凝膠連同玻璃板放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，待樣品冷卻至室溫，將樣品加入加樣孔內(nèi)，在第一個(gè)孔中加5μLMarker，其余各孔中加15μL樣品，將電泳槽和電泳儀相連，樣品在濃縮膠電泳時(shí)電壓設(shè)置為80V，在分離膠時(shí)電壓設(shè)置為120V。溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端，電泳終止。取出凝膠，切除凝膠多余部分。將PVDF膜根據(jù)膠的大小裁剪，隨后放在適量甲醇溶液中活化，裝配轉(zhuǎn)移三明治，打開(kāi)儀器進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。根據(jù)抗體孵育盒的寬度將PVDF膜裁剪成合適的大小后，放入抗體孵育盒中，孵育盒中加入適量Western洗滌液1×TBST溶液，在搖床上清洗PVDF膜五分鐘。洗滌完成后，孵育盒中加入適量5%脫脂奶粉，封閉1小時(shí)。隨后用1×TBST溶液清洗。一抗孵育：按照說(shuō)明書(shū)，一抗溶液中加入一抗稀釋液將其稀釋至合適濃度。取出PVDF膜，加入一抗溶液孵育1.5小時(shí)。孵育完成后用1×TBST溶液清洗PVDF膜。二抗孵育：按照說(shuō)明書(shū)，將二抗溶液使用二抗稀釋液稀釋至合適的濃度，SDF-1蛋白使用辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG(H+L)，GAPDH蛋白使用山羊抗兔lgGH&L(HRP)，在抗體孵育盒中加入適量二抗和PVDF膜于搖床上孵育1小時(shí)。孵育完成后使用1×TBST溶液清洗PVDF膜。發(fā)光成像：配制發(fā)光液，將膜置于玻璃板上，將發(fā)光液均勻撒在膜上，一分鐘后放在干凈的玻璃板上置于伯樂(lè)MP全能型成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。2.2.4酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)SDF-1蛋白水平的變化樣本處理：切取一定質(zhì)量的組織，使用PBS沖洗干凈；將組織裂解液添加到組織中，并將其冷凍勻漿。在勻漿結(jié)束后，將其離心，并將其上清用于實(shí)驗(yàn)。免疫檢測(cè)：板條的空白孔中加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品稀釋液，其余孔中加標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品，孵育。洗板，空白孔中加生物素化抗體稀釋液，其余孔中加生物素化抗體工作液，孵育。洗板，空白孔中加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔中加酶結(jié)合物工作液，孵育。洗板，孔中加顯色底物(TMB)，孵育。加入終止液，測(cè)量OD450值(3分鐘內(nèi))，記錄結(jié)果。第3章結(jié)果建立大鼠心肌梗死模型，將36只SD大鼠分為6組，并進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈降支結(jié)扎術(shù)（圖3-1）。為檢測(cè)心肌梗死后心臟各部分組織的SDF-1基因和蛋白表達(dá)情況，將取得的6組心臟，分別選取心肌梗死區(qū)、邊緣區(qū)和正常區(qū)的組織作為樣品進(jìn)行各檢測(cè)。圖3-1大鼠左冠狀動(dòng)脈降支結(jié)扎術(shù)。(a)大鼠麻醉后，用細(xì)棉線(xiàn)繩背臥位綁在大鼠固定板上。（b）用擴(kuò)胸器打開(kāi)胸腔。（c）用縫合針縫合傷口。(d)左手持彎嘴鑷，右手持剪刀剪開(kāi)大鼠腹部皮膚。（e）打開(kāi)大鼠胸膜腔。（f）取出心臟。熒光定量PCR方法檢測(cè)組織中SDF-1基因的表達(dá)情況（圖3-2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌梗死區(qū)SDF-1mRNA的表達(dá)隨疾病發(fā)展時(shí)間遞增，并在手術(shù)后2天表達(dá)量達(dá)峰值（圖3-2a）。邊緣區(qū)SDF-1mRNA的表達(dá)與心肌梗死區(qū)的表達(dá)相似，同樣在心肌梗死后2天時(shí)達(dá)到峰值，隨后迅速下降（圖3-2b）。而正常區(qū)SDF-1mRNA的表達(dá)量不大(圖3-2c)，且變化不顯著。圖3-2心肌梗死后SDF-1mRNA表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。（a）心肌梗死區(qū)SDF-1mRNA表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。（b）邊緣區(qū)SDF-1mRNA表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。（c）正常區(qū)SDF-1mRNA表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。n=6。運(yùn)用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)各樣品中SDF-1蛋白含量（圖3-3）。由于管家蛋白GAPDH蛋白通常具有一定的表達(dá)量，因此本研究采用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)蛋白質(zhì)定量分析和上樣分析中的誤差進(jìn)行修正，確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。圖中可以看出，心肌梗死區(qū)以及邊緣區(qū)的SDF-1蛋白都在術(shù)后2天時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值，且心肌梗死區(qū)SDF-1蛋白表達(dá)量顯著高于邊緣區(qū)，而正常區(qū)變化不大，表明SDF-1主要為應(yīng)對(duì)心肌梗死而增加。圖3-3心肌梗死后SDF-1蛋白表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。(a)(d)心肌梗死區(qū)在心肌梗死后表達(dá)SDF-1蛋白的時(shí)間過(guò)程。(b)(e)邊緣區(qū)在心肌梗死后表達(dá)SDF-1蛋白的時(shí)間進(jìn)程。(c)(f)正常區(qū)在心肌梗死后表達(dá)SDF-1蛋白的時(shí)間過(guò)程。n=6。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)結(jié)果表明（圖3-4），心肌梗死區(qū)SDF-1蛋白量迅速增加且在2天時(shí)含量最高，隨后逐漸降低（圖3-4a）；邊緣區(qū)蛋白表達(dá)同樣增加且在2天時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值，而正常區(qū)SDF-1蛋白量表達(dá)變化不顯著。圖3-4酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)SDF-1蛋白表達(dá)結(jié)果。（a）心肌梗死區(qū)SDF-1蛋白表達(dá)情況。（b）邊緣區(qū)SDF-1蛋白表達(dá)情況。（c）正常區(qū)SDF-1蛋白表達(dá)情況。n=6。第4章討論心肌梗死死亡率在我國(guó)居高不下，且呈現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢(shì)，因此對(duì)于心肌梗死的預(yù)防、診斷和治療的研究相當(dāng)迫切。已有研究表明心肌梗死后SDF-1的表達(dá)顯著增加，但對(duì)于該因子時(shí)空表達(dá)的認(rèn)識(shí)仍不足。本研究首次檢測(cè)心肌梗死后SDF-1的表達(dá)時(shí)序及空間分布區(qū)域表達(dá)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)心肌梗死后SDF-1基因和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示心梗區(qū)和邊緣區(qū)SDF-1基因和蛋白的表達(dá)明顯升高，且在2天時(shí)達(dá)峰值；正常區(qū)SDF-1基因和蛋白的變化不顯著。本研究證實(shí)了SDF-1對(duì)于心肌梗死后缺血組織的修復(fù)作用，擴(kuò)展了我們對(duì)于心肌梗死疾病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，更新了SDF-1表達(dá)時(shí)序的研究進(jìn)展并有助于后續(xù)開(kāi)展研究心梗的治療研究，為尋找治療心肌梗死新方法提供了新思路。第5章結(jié)論本研究運(yùn)用熒光定量PCR、蛋白免疫印跡方法和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死后心臟組織SDF-1的表達(dá)時(shí)序。結(jié)果表明，在心肌梗死后，心肌梗死區(qū)和邊緣區(qū)趨化因子SDF-1基因和蛋白的表達(dá)都會(huì)明顯增加，并且在2天時(shí)SDF-1的表達(dá)量達(dá)到峰值。正常區(qū)組織SDF-1基因的表達(dá)變化不太明顯，蛋白的表達(dá)量增加不顯著，說(shuō)明SDF-1基因和蛋白的表達(dá)增加可能為促進(jìn)心肌缺血區(qū)域組織的損傷修復(fù)起到一定作用。

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