T-SHZSAQS 00199-2023 奶牛隱性乳房炎抗性分子標(biāo)記檢測技術(shù)規(guī)程

學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載ICS

65.020.30學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載CCS

B

40 T/SHZSAQS

—2023奶牛隱性乳房炎抗性分子標(biāo)記檢測技術(shù)規(guī)程 石河子市質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會 發(fā)

布學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00199—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載 前言

................................................................................

II1

..............................................................................

12 規(guī)范性引用文件

....................................................................

13 術(shù)語和定義

........................................................................

1下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程。

.........................................................

13.1

生產(chǎn)性能測定......................................................................

13.2 KASP

高通量分型技術(shù)..............................................................

14 檢測牛群樣品采集

..................................................................

15 血液基因組

DNA

...............................................................

16

KASP

PCR

擴(kuò)增

...........................................................

27 結(jié)果與分型

........................................................................

2附錄

A（資料性）附表

1 PCR

反應(yīng)體系

................................................

3附錄

B（資料性）附表

2

分子標(biāo)記檢測引物

.......................................

4附錄

C（資料性）附表

3 PCR

擴(kuò)增反應(yīng)條件

............................................

5學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00199—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載 本文件參照

GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第

1

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。疆西部牧業(yè)股份有限公司、新疆天山軍墾牧業(yè)有限責(zé)任公司、新疆喀爾萬食品科技有限公司。本文件主要起草人：徐燁、葉翠芳、歐四海、林為民、楊陽、鄭煒、趙宗勝、吳培、張勇、II學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00199—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載奶牛隱性乳房炎抗性分子標(biāo)記檢測技術(shù)規(guī)程1 范圍本文件規(guī)定了奶牛隱性乳房炎抗性分子標(biāo)記檢測的術(shù)語與定義及血液基因組提取、基于KASP技術(shù)的PCR擴(kuò)增

、結(jié)果與分型等。適用于奶牛隱性乳房炎抗性分子標(biāo)記檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/DALN027 乳肉兼用牛隱性乳房炎診斷技術(shù)規(guī)范T/DALN032 規(guī)?；B(yǎng)殖場奶牛乳房保健技術(shù)規(guī)程3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程。3.1

生產(chǎn)性能測定奶牛亞臨床乳房炎，又稱隱性乳房炎，亞臨床乳房炎主要特征是奶牛的乳房和乳汁異常變化，通常通過實(shí)驗(yàn)室方法檢測到牛奶中炎癥細(xì)胞（體細(xì)胞）的增加，乳汁中體細(xì)胞數(shù)超過50萬pH值、氯化鈉、電導(dǎo)值等理化細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常乳汁。3.2

KASP

高通量分型技術(shù)競爭性等位基因特異PCR利用一種獨(dú)特形式的競爭性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過熒光報告系統(tǒng)，從核酸水平上識別和測量發(fā)生的遺傳變異，進(jìn)而檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的插入或缺失（Indels）。4 檢測牛群樣品采集4.1

通過尾靜脈采血，采集血液

5mL，使用

EDTA

溶液抗凝。5 血液基因組

DNA

提取5.1

參照血液基因組

DNA

提取試劑盒說明書提取基因組

。學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00199—2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載5.2

用紫外分光光度計和

瓊脂糖凝膠電泳檢測

的濃度和質(zhì)量。6 基于

KASP

技術(shù)的

6.1

擴(kuò)增體系（10μ

L）：KASP

2×Master

4μ

L、

1μ

L、2

個正向引物均為

0.15μ

L、反向引物

μ

L

dd

H2O

8μ

L

dd

H2O代替

樣品。（見附表

16.2

KASP

分子標(biāo)記檢測引物，見附表

2。6.3

擴(kuò)增反應(yīng)條件（見附表

3

擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，在室溫下，利用酶標(biāo)儀讀取熒光值。7 結(jié)果與分型利用LC480Software

軟件分析分型結(jié)果，用公司

View軟件展示。標(biāo)記為黃色的基因型樣品為

FAM標(biāo)記的等位基因是純合的，標(biāo)記為綠色的樣品為雜合。ｏｍ標(biāo)學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃ準(zhǔn)下載T/SHZSAQS 00199—2023ｏｍ標(biāo)學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃ準(zhǔn)下載AA附錄

A（資料性）

1 PCR

反應(yīng)體系組成Composition

96

孔板（μL）96-well

plates（μL）

384

孔板（μL）384-well

L）DNA 1 1SNP

Primer

Mix 0.14 0.072×KASP

Master

mix 4 2ddH2O 2.86 0.93總體積 8 4__---------．ｃｘｗ學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載A

基因

C＞A

．ｃｘｗ學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載B

基因

G＞C

C

基因

G＞A

D

基因

G＞A

T/SHZSAQS

00199—2023BB附錄

B（資料性）附表

2

分子標(biāo)記檢測引物熒光信號

引物

序列（5’-3’）FAM

F1

GAGACACTTGGAGAGAATGGAGCHEX

F2

GGAGACACTTGGAGAGAATGGAGA/

R

CAGCGTGGAGTTGTAAGTTATAGAGAFAM

F1

CCAAATGGGGCACAAGCACHEX

F2

CCAAATGGGGCACAAGCAG/

R

GCCCTCATGAGGGTGTCCGFAM

F1

CAGATGCTCTCCACCTACACAGGHEX

F2

CCAGATGCTCTCCACCTACACAGA/

R

TTCTGTGACCACAAAACCAGAGGFAM

F1

GGACAACTACAAGGTCTACAACACAHEX

F2

GGACAACTACAAGGTCTACAACACG/

R

CTTCTTGGTCCTAATGCCCTCAGA下ｏｍ標(biāo)準(zhǔn)學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃ載T/SHZSAQS 00199—2023下ｏｍ標(biāo)準(zhǔn)學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃ載CC附錄

C（資料性）

3 PCR

擴(kuò)增反應(yīng)條件步驟Steps

過程Process

溫度/°CTemperature

時間Time

循環(huán)數(shù)Number

of

cycles1 預(yù)變性 95 10

min 1

cycle變性 95 20