生物技術(shù)概論課件

1.生物技術(shù)總論

學(xué)習(xí)目的了解生物技術(shù)的含義、特點(diǎn)以及生物技術(shù)的發(fā)展史。掌握生物技術(shù)的各項(xiàng)技術(shù)及其相互關(guān)系。認(rèn)識生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域及其對人類社會發(fā)展的影響。生物技術(shù)被世界各國視為一項(xiàng)高新技術(shù)，它廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)林牧漁、輕工、食品、化工和能源等領(lǐng)域，促進(jìn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)改造和新興產(chǎn)業(yè)的形成，對人類社會生活將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的、革命性的影響。生物技術(shù)不完全是一門新興學(xué)科，它包括傳統(tǒng)生物技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)兩部分。

生物技術(shù)總論

引言1.1生物技術(shù)的含義1.1.1生物技術(shù)的定義生物技術(shù)(biotechnology),有時(shí)也稱生物工程(bioengineering)，是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的工程技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。因此，生物技術(shù)是一門新興的、綜合性的學(xué)科。

生物技術(shù)總論

1生物技術(shù)總論

微生物工程菌發(fā)酵工程基因工程蛋白質(zhì)或酶蛋白質(zhì)工程或酶工程產(chǎn)品

動、植物個(gè)體或細(xì)胞細(xì)胞工程

優(yōu)良動、植物品系1.1.2生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系

生物技術(shù)總論

1.1生物技術(shù)的含義

1.1.2.1基因工程(geneengineering)

應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)，通常是脫氧核糖核酸(DNA)分離出來,在體外進(jìn)行切割、拼接和重組。然后將重組了的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞或個(gè)體，從而改變它們的遺傳品性；有時(shí)還使新的遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個(gè)體中大量表達(dá)，以獲得基因產(chǎn)物(多肽或蛋白質(zhì))。也稱DNA重組技術(shù)。

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1.1.2生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系1.1.2.2細(xì)胞工程(cellengineering)指以細(xì)胞為基本單位，在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖；或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種；或加速繁育動、植物個(gè)體；以獲得某種有用的物質(zhì)的過程。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞融合細(xì)胞重構(gòu)

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1.1.2生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系1.1.2.3

酶工程(enzymeengineering)

利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能,或?qū)γ高M(jìn)行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項(xiàng)技術(shù)。它包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞的固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)等技術(shù)。

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1.1.2生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系1.1.2.4發(fā)酵工程(fermentationengineering)

利用微生物生長速度快、生長條件簡單以及代謝過程特殊等特點(diǎn)，在合適條件下，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)手段，由微生物的某種特定功能生產(chǎn)出人類所需的產(chǎn)品稱為發(fā)酵工程，也稱微生物工程。

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1.1.2生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系1.1.2.5蛋白質(zhì)工程（proteinengineering）是指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識，通過對基因的人工定向改造等手段，從而達(dá)到對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造、拼接以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)。

生物技術(shù)總論

1.1.2生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系

1.1.3生物技術(shù)所涉及的學(xué)科

現(xiàn)代生物技術(shù)是所有自然科學(xué)領(lǐng)域中涵蓋范圍最廣的學(xué)科之一。它以包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫生物學(xué)、人體生理學(xué)、動物生理學(xué)、植物生理學(xué)、微生物生理學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)等幾乎所有生物科學(xué)的次級學(xué)科為支撐，又結(jié)合了諸如化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)、數(shù)學(xué)、微電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域之外的尖端基礎(chǔ)學(xué)科,從而形成一門多學(xué)科互相滲透的綜合性學(xué)科。其中又以生命科學(xué)領(lǐng)域的重大理論和技術(shù)的突破為基礎(chǔ)。

生物技術(shù)總論

1.1生物技術(shù)的含義

生物技術(shù)總論

1.1.3生物技術(shù)所涉及的學(xué)科

生物技術(shù)所涉及的行業(yè)種類

行業(yè)種類經(jīng)營范圍

疾病治療用于控制人類疾病的醫(yī)藥產(chǎn)品及技術(shù),包括抗生素、生物藥品、基因治療、干細(xì)胞利用等診斷臨床檢測與診斷，食品、環(huán)境與農(nóng)業(yè)檢測農(nóng)業(yè)、林業(yè)與園藝新的農(nóng)作物或動物，肥料，生物農(nóng)藥食品擴(kuò)大食品、飲料及營養(yǎng)素的來源環(huán)境廢物處理、生物凈化、環(huán)境治理能源能源的開采、新能源的開發(fā)化學(xué)品酶、DNA/RNA及特殊化學(xué)品設(shè)備由生物技術(shù)生產(chǎn)的金屬、生物反應(yīng)器、計(jì)算機(jī)芯片及生物技術(shù)使用的設(shè)備等

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1.1.3生物技術(shù)所涉及的學(xué)科傳統(tǒng)生物技術(shù)

現(xiàn)代生物技術(shù)1.2生物技術(shù)發(fā)展簡史

生物技術(shù)總論

1生物技術(shù)總論

1.2.1傳統(tǒng)生物技術(shù)的產(chǎn)生傳統(tǒng)生物技術(shù)應(yīng)該說從史前時(shí)代起就一直為人們所開發(fā)和利用，以造福人類。在石器時(shí)代后期，我國人民就會利用谷物造酒，這是最早的發(fā)酵技術(shù)?！艄爬系尼勗旒夹g(shù)◆巴斯德的發(fā)現(xiàn)

生物技術(shù)總論

1.2生物技術(shù)發(fā)展簡史1.2.2現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展

理論背景：現(xiàn)代生物技術(shù)是以20世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志的。

◆

1944年Avery等闡明了DNA是遺傳信息的攜帶者

◆

1953年Watson&Crick發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

開創(chuàng)分子生物學(xué)

◆

1961年H.G.Khorana&M.W.Nirenberg破譯了遺傳密碼,揭開了DNA編碼的遺傳信息是如何傳遞給蛋白質(zhì)這一秘密生物技術(shù)總論

現(xiàn)代生物技術(shù)的誕生1973年加州大學(xué)的Cohen等實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間遺傳物質(zhì)的人工重組，轉(zhuǎn)入一個(gè)抗藥基因，使大腸桿菌獲得了抗藥性，第一例DNA重組技術(shù)成功1.2.2現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展生物技術(shù)總論1978年Genetech公司和洛衫磯Hope市醫(yī)學(xué)中心將具有明顯醫(yī)藥實(shí)用價(jià)值的蛋白質(zhì)胰島素基因?qū)氲紼.coli

中表達(dá)成功1980轉(zhuǎn)基因動物首獲成功，美國人得到轉(zhuǎn)人生長激素基因的超級鼠1983年美國人和比利時(shí)人將外源基因引入植物中，并穩(wěn)定遺傳1997年第一只克隆羊在英國Rosslyn研究所誕生

現(xiàn)代生物技術(shù)的誕生1.2.2現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展生物技術(shù)總論

生物技術(shù)的發(fā)展將越來越深刻地影響著世界經(jīng)濟(jì)、軍事和社會發(fā)展的進(jìn)程。

1.3生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響

生物技術(shù)總論

1生物技術(shù)總論1.3.1改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決食品短缺

提高農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)培育抗逆的作物優(yōu)良品系植物種苗的工廠化生產(chǎn)提高糧食品質(zhì)生物固氮，減少化肥使用量

發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)動物的大量快速無性繁殖培育動物的優(yōu)良品系

生物技術(shù)總論

1.3生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響

開發(fā)制造貴重的新型藥品疾病的預(yù)防和診斷基因治療人類基因組計(jì)劃1.3.2提高生命質(zhì)量，延長人類壽命

生物技術(shù)總論

1.3生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響

美國生物技術(shù)產(chǎn)品銷售及預(yù)測（百萬美元）

領(lǐng)域1998年2003年2008年增長率%

人類疾病治療9120161002700011

人類疾病診斷2100310043007

農(nóng)業(yè)4201000230019

特制品390900200018

非醫(yī)療檢驗(yàn)2704006008

合計(jì)1230021503620011

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1.3.2提高生命質(zhì)量，延長人類壽命美國工業(yè)化生物技術(shù)研究與發(fā)展基金分布圖

生物技術(shù)總論

1.3.2提高生命質(zhì)量，延長人類壽命

解決能源危機(jī)生物能源將是最有希望的新能源之一，而其中又以乙醇最有希望成為新的替代能源。

保護(hù)環(huán)境人們可以利用微生物凈化有毒的化合物，降解石油污染，清除有毒氣體和惡臭物質(zhì)，綜合利用廢水和廢渣，處理有毒金屬，達(dá)到凈化環(huán)境、保護(hù)環(huán)境、廢物利用并獲得新的產(chǎn)品的目的。1.3.3解決能源危機(jī)、治理環(huán)境污染

生物技術(shù)總論

1.3生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響

制造工業(yè)原料

利用微生物在生長過程中積累的代謝產(chǎn)物,生產(chǎn)食品工業(yè)原料,種類繁多。

生產(chǎn)貴重金屬

利用微生物的浸礦技術(shù)對廢渣礦、貧礦、尾礦、廢礦進(jìn)行提煉。1.3.4制造工業(yè)原料、生產(chǎn)貴重金屬

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1.3生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響

基因工程對微生物的改造是否會產(chǎn)生某種有致病性的微生物，這些微生物都帶有特殊的致病基因，如果它們從實(shí)驗(yàn)室逸出并且擴(kuò)散，有可能造成類似鼠疫那樣的可怕疾病的流行。轉(zhuǎn)基因作物及食品的生產(chǎn)和銷售，是否對人類和環(huán)境造成長期的影響，擅自改變植物基因是否可能引起一些難以預(yù)料的危險(xiǎn)。1.3.5生物技術(shù)的安全及其對倫理、道德、法律的影響

生物技術(shù)總論

1.3生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響

分子克隆技術(shù)在人類身上的應(yīng)用可能造成巨大的社會問題，并對人類自身的進(jìn)化產(chǎn)生影響；而應(yīng)用在其他生物上同樣具有危險(xiǎn)性，因?yàn)樗鶆?chuàng)造出的新物種有可能具有極強(qiáng)的破壞力而引發(fā)一場浩劫。生物技術(shù)的發(fā)展將不可避免地推動生物武器的研制與發(fā)展，使籠罩在人類頭上的生存陰影越來越大。動物克隆技術(shù)的建立，如果被某些人用來制造克隆人、超人，將可能破壞整個(gè)人類社會的和平。

生物技術(shù)總論

1.3.5生物技術(shù)的安全及其對倫理、道德、法律的影響復(fù)習(xí)思考題現(xiàn)代生物技術(shù)是一項(xiàng)高技術(shù)，它具有高技術(shù)的“六高”特征是指哪“六高”？什么是生物技術(shù)，它包括哪些基本的內(nèi)容？它對人類社會將產(chǎn)生怎么樣的影響？為什么說生物技術(shù)是一門綜合性的學(xué)科，它與其他學(xué)科有什么關(guān)系？簡要說明生物技術(shù)的發(fā)展史以及現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)生物技術(shù)的關(guān)系。生物技術(shù)的應(yīng)用包括哪些領(lǐng)域？

生物技術(shù)總論

1生物技術(shù)總論主要參考文獻(xiàn)1.顧方舟，盧圣棟.生物技術(shù)的現(xiàn)狀與未來.北京：北京醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社.19902．中國生物工程開發(fā)中心生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)＜椅瘑T會.中國生物技術(shù)的崛起——生物技術(shù)領(lǐng)域十年發(fā)展歷程.（內(nèi)部刊物）.19963．林綿湖譯.21世紀(jì)的生物技術(shù)——實(shí)現(xiàn)諾言（內(nèi)部刊物）.19954．朱圣庚等.生物技術(shù).上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社.19955．李亞一等.生物技術(shù)——跨世紀(jì)技術(shù)革命的主角.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社.19946．王聯(lián)結(jié).生物工程概論.北京：中國輕工業(yè)出版社.20027．何忠效等.現(xiàn)代生物技術(shù)概論.北京：北京師范大學(xué)出版社.19998.國家發(fā)展和改革委員會高技術(shù)產(chǎn)業(yè)司，中國生物工程學(xué)會.中國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告（2003）.北京：化學(xué)工業(yè)出版社.20039.王宏廣.發(fā)展生物技術(shù)引領(lǐng)生物經(jīng)濟(jì).北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2005

（宋思揚(yáng)編寫）

生物技術(shù)總論

1生物技術(shù)總論基因工程

2.1基因工程概況

2.1.1基因工程的基本含義

按照人們的愿望（人為的），進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)（類似工程設(shè)計(jì)），通過體外DNA重組（非生命活動過程）和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有的物種在較短的時(shí)間內(nèi)趨于完善（區(qū)別于自然突變和常規(guī)育種），創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型;利用這種技術(shù)對人類疾病進(jìn)行有效的診斷和治療?；蚬こ?基因工程2.1.2基因工程的主要理論依據(jù)不同基因具有相同的遺傳物質(zhì)(DNA/RNA)基因是可以從DNA上切割下來的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的(絕少數(shù)除外)可以通過DNA復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代基因工程2.1基因工程概況2.1.3基因工程研究的基本技術(shù)路線基因工程2.1基因工程概況2.1.4基因工程突出的優(yōu)點(diǎn)打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限可以使原核生物與真核生物之間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移可以使動物與植物之間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移可以使人與其他生物間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移基因工程2.1基因工程概況2.2.1DNA

2.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)基因工程2基因工程

DNA由腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成。

脫氧核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸基組成。

四種脫氧核苷酸的脫氧核糖、磷酸基的結(jié)構(gòu)和位置相同，只是各自的堿基不同。

2.2DNA重組堿基有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種。脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵連接。多個(gè)脫氧核苷酸按此方法連接成多聚脫氧核苷酸，其一端為游離的5′-磷酸基(5′-P)稱為5′端；另其一端為游離的3′

-羥基(3′-OH),稱為3’端?；蚬こ?.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)基因工程2.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

DNA兩條脫氧核苷酸鏈總是按照堿基A與T互補(bǔ)配對和G與C互補(bǔ)配對的，通過氫鍵形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為雙鏈DNA。少數(shù)病毒和噬菌體中的DNA是以單鏈形式存在的?；蚬こ?.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)B-DNA雙螺旋分子模型基因工程2.2.1.1DNA的組成和結(jié)構(gòu)

2.2.1.2DNA的功能

（1）DNA分子能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

以原有的DNA鏈為模板，從特定的復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）起始，復(fù)制出新的DNA鏈。

（2）DNA是基因的主要攜帶者

一個(gè)基因是DNA分子上的一個(gè)特定的核苷酸序列。

基因工程2.2.1DNA基因工程2.2.1.2DNA的功能

原核生物基因啟動子相關(guān)的保守核苷酸序列

Pribnow框或-10區(qū)：

-4~-13bp之間由６個(gè)核苷酸組成，多數(shù)是TATAAT序列。-35區(qū)：-35bp前后保守的TTGACA序列。動、植物基因啟動子相關(guān)的保守核苷酸序列生物類型

TATA區(qū)（-25~-30）

CAAT區(qū)（-70~-80）

GC區(qū)（-80~-100）動物TATAATAGGCCAACTGCCACACCC植物TCTATATA1~3CA或TGTATAAA1~3CACA2~5GNGA2~4CC或TA2~5TNGA2~4TTGGGCGGG基因工程2.2.1.2DNA的功能終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列基因工程2.2.1.2DNA的功能

2.2.2獲得DNA片段的主要途徑目的：（1）獲得含有基因的DNA片段（2）獲得含有基因表達(dá)調(diào)控因子的DNA片段（3）獲得含有與基因重組有關(guān)的核苷酸序列的DNA片段主要途徑：（1）限制性內(nèi)切核酸酶酶切法（2）PCR擴(kuò)增法（3）化學(xué)合成法基因工程2.2DNA重組2.2.2.1限制性內(nèi)切核酸酶和DNA片段化

限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendonuclease)

功能：能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列,并在合適的反應(yīng)條件下,使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開,產(chǎn)生具有3′-OH和5′-P的DNA片段。

命名：HindIII由HaemophilusinfluenzaeRd中屬名的H,種名的in和菌株代號的d組成,III表示從此菌株中提取的第三種限制性內(nèi)切核酸酶。

識別序列規(guī)律：旋轉(zhuǎn)對稱或左右互補(bǔ)對稱。

切割位點(diǎn):在識別序列上使磷酸二酯鍵斷開的位置。

基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑限制性內(nèi)切核酸酶識別序列、酶切位點(diǎn)和酶切片段末端基因工程2.2.2.1限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化粘性末端：產(chǎn)生的DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個(gè)核苷酸。3′端比5′端長的稱為3′粘性末端，5′端比3′端長的稱為5′粘性末端。平末端：產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的。限制性內(nèi)切核酸酶的切割方法:

單酶切法雙酶切法完全酶切法部分酶切方法環(huán)狀DNA酶切片段示意圖基因工程2.2.2.1限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化2.2.2.2特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增特點(diǎn)：體外高效擴(kuò)增特異DNA片段。一個(gè)待擴(kuò)增的DNA片段，在3h內(nèi)可擴(kuò)增出約106個(gè)這樣的DNA片段。關(guān)鍵因子：

※耐熱性DNA聚合酶

※引物

基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑反應(yīng)過程：※

反應(yīng)系統(tǒng)加熱至90~95℃,底物雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA；※

降溫至37~60℃,使引物與模板DNA鏈互補(bǔ)序列雜交(復(fù)性)；※

升溫至70~75℃，耐熱性DNA聚合酶催化引物按5′→3′方向延伸,合成模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈?！?/p>

重復(fù)以上過程，一般經(jīng)過25～30次循環(huán)片段?；蚬こ?.2.2.2特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增基因工程2.2.2.2特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增2.2.2.3化學(xué)合成目的基因

根據(jù)待合成的DNA片段預(yù)定的核苷酸序列，采用DNA合成儀，將4種核苷酸單體按3′→5′磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。基因工程2.2.2獲得DNA片段的主要途徑DNA合成儀2.2.3DNA片段的連接2.2.3.1DNA連接酶（DNAligase）催化機(jī)理：催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3′-OH末端與5′

-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前常用的連接酶：

E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶。基因工程2.2DNA重組具互補(bǔ)粘性末端片段之間的連接基因工程2.2.3DNA片段的連接2.2.3.2DNA片段之間的連接

基因工程2.2.3.2DNA片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接

基因工程2.2.3.2DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接

基因工程2.2.3.2DNA片段之間的連接DNA片段脫磷酸化后連接DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接

基因工程2.2.3.2DNA片段之間的連接DNA片段加連桿后或加銜接頭連接

基因工程2.2.3.2DNA片段之間的連接

2.2.3.3DNA重組類型

插入重組置換重組基因工程2.2.3DNA片段的連接基因工程2基因工程

基因克隆載體的含義能夠承載外源基因，并將其帶入受體細(xì)胞得以相對穩(wěn)定維持的DNA分子稱為基因克隆載體（genecloningvector）?；蚩寺≥d體應(yīng)具備的基本條件具有1個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)。進(jìn)入受體細(xì)胞后，一般是能夠以不同的形式進(jìn)行復(fù)制。含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因?？寺≥d體必須是安全的。2.3基因克隆載體克隆載體種類按構(gòu)建克隆載體的材料來源分:質(zhì)?？寺≥d體、病毒（噬菌體）克隆載體、線粒體克隆載、人工染色體克隆載體、葉綠體克隆載體......按克隆載體的用途分:一般克隆載體、表達(dá)載體、建庫載體、T或U載體......

基因工程

2.3基因克隆載體按克隆載體的受體生物分:原核生物克隆載體大腸桿菌克隆載體、放線菌克隆載體......真核生物克隆載體酵母克隆載體、植物克隆載體、動物克隆載體、人克隆載體......

基因工程

2.3基因克隆載體克隆載體種類含義：以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體，必須含有質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。種類：大腸桿菌質(zhì)粒載體藍(lán)藻穿梭質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體酵母2μm質(zhì)粒載體

......2.3.1質(zhì)?？寺≥d體基因工程2.3基因克隆載體質(zhì)粒DNA基因工程

2.3.1質(zhì)?？寺≥d體pBR322簡圖基因工程

2.3.1質(zhì)粒克隆載體基因工程

2.3.1質(zhì)?？寺≥d體基因工程

2.3.1質(zhì)粒克隆載體基因工程

2.3.1質(zhì)?？寺≥d體基因工程

2.3.1質(zhì)?？寺≥d體含義以病毒（噬菌體）DNA或cDNA為主構(gòu)建的克隆載體，或者通過轉(zhuǎn)染直接進(jìn)入宿主細(xì)胞，或者包裝成病毒顆粒后通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞。種類噬菌體克隆載體：λ噬菌體克隆載體

Cosmid載體植物病毒克隆載體：CaMV克隆載體動物病毒克隆載體：痘苗病毒載體腺病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體基因工程

2.3基因克隆載體入噬菌體載體gtwes-λB

基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體痘苗病毒載體示意圖基因工程

2.3.2病毒（噬菌體）克隆載體2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

（1）含義：指能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制并準(zhǔn)確傳遞給子細(xì)胞的人工構(gòu)建的染色體。（2）特點(diǎn)：能容納長達(dá)1000kb以上的外源DNA片段。（3）用途：構(gòu)建基因組文庫,克隆和轉(zhuǎn)移完整的高分子量基因,基因功能鑒定,基因治療……

基因工程

2.3基因克隆載體（4）類型：線形的人工染色體：必須含有端粒、著絲粒和復(fù)制起始區(qū)。包含：酵母人工染色體（YAC)人類人工染色體（HAC)哺乳動物人工染色體（MAC)環(huán)形的人工染色體：不需要端粒和著絲粒，但必須含有合適的復(fù)制起始區(qū)。包含：細(xì)菌人工染色體(BAC)

源于噬菌體Ｐ1的人工染色體(PAC)

雙元細(xì)菌人工染色體(BIBAC)

可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

基因工程

2.3.3人工染色體載體——大DNA片段克隆載體

2.3.4體內(nèi)同源重組整合載體（系統(tǒng)）2.3.4.1常規(guī)基因整合平臺系統(tǒng)

內(nèi)源平臺雙交換置換載體內(nèi)源平臺雙交換插入載體內(nèi)源平臺單交換插入載體外源平臺雙交換插入載體基因工程

2.3基因克隆載體基因工程

2.3.4.1常規(guī)基因整合平臺系統(tǒng)loxP位點(diǎn)序列示意圖2.3.4.2基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統(tǒng)基因工程

2.3.4體內(nèi)同源重組整合載體（系統(tǒng)）基因工程

2.3.4.2基于噬菌體P1的Cre/lox定位重組系統(tǒng)2.4.1目的基因來源

目的基因：在基因工程設(shè)計(jì)和操作中，被用于基因重組、改變受體細(xì)胞性狀和獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。

目的基因的生物來源:

真核生物染色體基因組

原核生物染色體基因組質(zhì)?；蚪M病毒（噬菌體）基因組

線粒體基因組葉綠體基因組

基因工程2基因工程2.4獲得目的基因2.4.2分離目的基因的途徑

2.4.2.1利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切法直接分離目的基因

基因工程2.4獲得目的基因PCR擴(kuò)增含目的基因DNA示意基因工程2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.2利用PCR直接擴(kuò)增目的基因基因工程2.4.2分離目的基因的途徑2.4.2.3目的基因的化學(xué)合成2.4.2.4通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離的基因基因工程2.4.2分離目的基因的途徑基因工程2.4.2.4通過構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因

2.5.1受體細(xì)胞

2.5.1.1原核生物

種類：大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)細(xì)菌、棒狀桿菌、放線菌等基因工程2基因工程2.5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞特點(diǎn)：大部分原核生物細(xì)胞沒有纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA的進(jìn)入;沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩;

基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析；原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡單,繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。基因工程2.5.1.1原核生物2.5.1.2真核生物特點(diǎn)：真核生物細(xì)胞具備真核基因表達(dá)調(diào)控以及表達(dá)產(chǎn)物加工和分泌等的機(jī)制，因此作為受體細(xì)胞表達(dá)真核基因優(yōu)于原核生物細(xì)胞。

基因工程2.5.1受體細(xì)胞真核細(xì)胞模式圖種類：

酵母：基因結(jié)構(gòu)相對比較簡單，便于基因工程操作；培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉；外源基因表達(dá)產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中,便于產(chǎn)物的提取和加工；不含特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細(xì)胞。植物細(xì)胞：具全能性。有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草和擬南芥等。動物細(xì)胞：目前多采用生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞以及干細(xì)胞。有豬、羊、牛、魚、鼠、猴等。基因工程2.5.1.2真核生物

2.5.2重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

2.5.2.1外源DNA轉(zhuǎn)化方法化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

電穿孔轉(zhuǎn)化法

微彈轟擊(基因槍)轉(zhuǎn)化法

基因工程2基因工程2.5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法

超聲波處理轉(zhuǎn)化法脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化法花粉管通道轉(zhuǎn)化法精子介導(dǎo)法低能離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法基因工程2.5.2.1外源DNA轉(zhuǎn)化方法電穿孔儀2.5.2.2病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法

用病毒(噬菌體)的DNA（或cDNA）構(gòu)建成重組DNA，在體外包裝成重組病毒(噬菌體)顆粒，通過感染使重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。

基因工程2.5.2重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞方式：重組病毒直接感染受體細(xì)胞重組病毒同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞重組病毒感染互補(bǔ)型受體細(xì)胞系適用：主要用于基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和動植物的轉(zhuǎn)基因?；蚬こ?.5.2.2病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法基因工程2.5.2.2病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法2.5.3克隆子的篩選2.5.3.1根據(jù)載體標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)載體抗菌素抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)載體除草劑抗性基因篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)LacZ′基因互補(bǔ)顯色篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)生長調(diào)節(jié)劑非依賴型篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)核苷酸合成代謝相關(guān)酶基因缺失互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子基因工程2.5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.5.3.2根據(jù)報(bào)告基因篩選轉(zhuǎn)化子β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）

螢火蟲熒光素酶基因（luc）綠色熒光蛋白基因（gfp）2.5.3.3根據(jù)形成噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子

基因工程2.5.3克隆子的篩選2.6.1根據(jù)重組DNA分子特征鑒定重組子

2.6.1.1根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子2.6.1.2根據(jù)重組DNA分子酶切圖譜鑒定重組子2.6.1.3根據(jù)PCR擴(kuò)增片段鑒定重組子基因工程2基因工程2.6重組子的鑒定

2.6.1.4采用DNA分子雜交法鑒定重組子Southern印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交菌落（或噬菌斑）原位雜交基因工程2.6.1根據(jù)重組DNA分子鑒定重組子基因工程2.6.1.4采用DNA分子雜交法鑒定重組子Southern印跡雜交基因工程2.6.1.4采用DNA分子