微生物學基礎(chǔ)知識

PAGEPAGE14GMP培訓(xùn)教材微生物學基礎(chǔ)知識主編夏俊強北京宏馬明泰生物科技有限公司編制第一章緒言藥品衛(wèi)生是藥廠管理的一項重要工作內(nèi)容，是藥品制備過程中加強文明生產(chǎn)，保證成品質(zhì)量，防止微生物污染的重要措施，也是實行GMP制度的具體保證。藥品衛(wèi)生主要論述藥品微生物學方面的要求及達到要求所采取的措施與方法。藥品不僅要具有確切的療效，而且必須安全可靠，質(zhì)量穩(wěn)定，便于長期保存。當藥品一旦被微生物污染后，在一定的條件下微生物就會生長繁殖，導(dǎo)致藥品變質(zhì)、腐敗，使療效降低或喪失，甚至可能產(chǎn)生一些對人體有害的物質(zhì)，應(yīng)用后，不僅不能達到預(yù)期的防治目的，而且往往會引起機體感染、發(fā)熱，甚至產(chǎn)生中毒等不良反應(yīng)。制藥工程的現(xiàn)代化對藥品衛(wèi)生提出更高的要求。藥品衛(wèi)生作為保證藥品質(zhì)量的重要因素，正得到人們越來越廣泛的重視。在制藥過程中所涉及的每一個環(huán)節(jié)，都應(yīng)當十分注意藥品衛(wèi)生的問題。對于直接注入機體，用于創(chuàng)口表面、眼部和外科手術(shù)的滅菌產(chǎn)品，如注射劑、眼用制劑、止血劑、人血漿制劑及血漿代用品等，應(yīng)該不含有微生物，至少不得含有活的微生物，而對于一些口服的非滅菌產(chǎn)品，如合劑、糖漿劑、丸劑、顆粒劑、片劑等，雖然允許在一定范圍內(nèi)含有微生物，但不得有致病性微生物存在。為了使藥品中不含或少含微生物，必須根據(jù)藥品衛(wèi)生的具體要求，針對藥品生產(chǎn)過程中的每一環(huán)節(jié)，采取切實有效的綜合措施，確保產(chǎn)品質(zhì)量。因此，面對藥品生產(chǎn)的現(xiàn)狀，積極研究如何防止藥品被微生物污染、如何抑制微生物在藥品中的生長繁殖、如何殺滅或除去藥品中的微生物等問題，并不斷采用新技術(shù)新措施，對于藥品質(zhì)量的提高和制藥工業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。1.1什么是微生物微生物是指在光學顯微鏡或電子顯微鏡下才能看到的微小生物。一般細菌的大小介于0.2μm到幾個μm之間，病毒只有20—300nm左右的大小，它們的結(jié)構(gòu)亦較簡單。微生物對外界環(huán)境適應(yīng)性較強，能迅速吸收營養(yǎng)物質(zhì)很快繁殖。微生物的種類繁多，在自然界分布很廣。微生物學的任務(wù)是研究微生物在一定條件下的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生命活動及其規(guī)律、進化、分類以及人類、動植物、自然界相互的關(guān)系。本課程著重討論與藥品生產(chǎn)過程有關(guān)的微生物。1.2微生物的分類它們的種類很多，根據(jù)其結(jié)構(gòu)分屬于三個類型共八種。（1）非細胞型微生物：無細胞結(jié)構(gòu)，個體極小，能通過細菌濾器，只能在活細胞內(nèi)生長繁殖。病毒屬此。（2）原核細胞型微生物：雖有細胞結(jié)構(gòu)，但僅有原始核，無核膜和核仁，細胞器很少。細菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體屬此。（3）真核細胞型微生物：有細胞結(jié)構(gòu)，細胞核分化程度較高，有核膜、核仁、染色體，細胞質(zhì)內(nèi)有完整的細胞器。真菌屬此。1．3微生物學發(fā)展史1．3．1我國古代對微生物及傳染病的認識1．3．2微生物形態(tài)學時期1．3．3微生物生理學時期1．3．4免疫學萌芽時期1．3．5病毒的發(fā)現(xiàn)1．3．6化學治療劑與抗生素的發(fā)現(xiàn)1．3．7現(xiàn)代微生物與免疫學第二章細菌的生物學特性2．1細菌的形態(tài)與構(gòu)造細菌是一類具有細胞壁的單細胞生物,屬于原核細菌型微生物。各種細菌在一定環(huán)境條件下，有相對恒定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。了解細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)特點，對于鑒別細菌、診斷疾病和研究細菌的致病性與免疫性，都具有重要意義。2．1．1細菌的大小與形態(tài)細菌體積微小，通常以微米（簡寫為,等于1/1000mm）為測量大小的單位。一般需用顯微鏡放大幾百倍才能看到。根據(jù)細菌的基本形態(tài)可將其分成三類：球菌、桿菌和彎曲狀菌。（1）球菌：單個球菌呈球形或近似球形，直徑約1根據(jù)細胞分裂的方向和分裂后排列方式又可分為：①雙球菌：細菌在一個平面上分裂，分裂后兩個成對排列，如腦膜炎球菌。②鏈球菌：在一個平面上分裂，后兩面?zhèn)€成對排列，如腦膜炎球菌、淋病雙球菌。③葡萄球菌：在多個平面上分裂，后菌體堆積呈葡萄狀，如金黃色葡萄球菌。也有的球菌在兩個或三個互相垂直的平面上分裂，并排列成四聯(lián)球菌或八疊球菌。（2）桿菌：菌體一般呈直桿狀，有的細長或稍彎曲。桿菌種類很多，大小形狀很不一致。大桿菌如炭疽桿菌度約3-10um，中等大小的桿菌如大腸桿菌長約2-3um，小桿菌如流感桿菌長約0.7-1.5um.大多數(shù)桿菌兩端鈍圓，少數(shù)兩端齊（如炭疽桿菌）。有的兩端膨大呈棒狀（如白喉桿菌）。桿菌多單獨存在，有的也可成對或鏈狀排列。（3）彎曲狀菌：菌體呈彎曲狀又叫螺形菌。①弧菌：菌體只有一個彎曲呈弧形，如霍亂弧菌。②螺菌：菌體有數(shù)個彎曲，較為堅韌，如鼠咬熱螺菌。③彎曲菌：菌體有單個或多個彎曲，如空腸彎曲菌。細菌在適宜條件下，保持其固有的典型形態(tài)。當環(huán)境條件變化時，其形態(tài)可發(fā)生改變，可出現(xiàn)多形態(tài)或細胞壁缺陷菌。2．1．2細菌細胞的構(gòu)造【細菌的基本構(gòu)造】.是指各種細菌都具有的細胞結(jié)構(gòu)。（1）細胞壁細胞壁主要功能①物質(zhì)交換②保護作用③具抗原性（2）細胞膜細胞膜的主要功能①物質(zhì)交換②生物合成③能量產(chǎn)生（3）細胞質(zhì)其中含有多種酶系統(tǒng)，是進行新陳代謝的重要場所。細胞質(zhì)內(nèi)還有多種重要成分如：質(zhì)粒、核蛋白體、內(nèi)含小體、核質(zhì)。【細菌的特殊構(gòu)造】是指某些細菌所特有的構(gòu)造。(1)莢膜有些細菌分泌粘液包圍在細胞壁外面，形成肥厚的粘液層，稱為莢膜。其主要功能：①保護作用與細菌致病性有關(guān)②抗原性③不容易著色（2）鞭毛許多細菌的表面具有細長彎曲的絲狀物，稱為鞭毛。鞭毛是細菌的運動器官（3）菌毛是存在于細菌表面纖細、短而直的毛狀結(jié)構(gòu)。化學成分主要是蛋白質(zhì)。（4）芽胞是在一定條件下菌體形成多層膜質(zhì)結(jié)構(gòu)的圓形或卵圓形小體，稱為芽胞。在適宜條件下，即被激活發(fā)芽生成新的菌體，一個芽胞只能再生長為一個菌體（一個細菌只能形成一個芽胞），故芽胞的生成不是細菌的繁殖方式。對具有繁殖能力的細菌通常稱為繁殖體。2．1．3細菌形態(tài)學檢查法原則細菌微小且透明，一般要染色經(jīng)顯微鏡放大后，才清晰可見。目前細菌染色技術(shù)和光學顯微鏡觀察，仍為細菌形態(tài)學檢查最重要和普遍應(yīng)用的方法。主要方法：（1）單染色法（2）革蘭氏染色法（3）抗酸染色法（4）特殊染色法2．2細菌的生理本節(jié)的內(nèi)容包括細菌的營養(yǎng)、代謝、生長繁殖等生理活動規(guī)律。2．2．1細菌的營養(yǎng)各種細菌的生理功能差別很大，因而各自的營養(yǎng)需要也不一致。一般需要營養(yǎng)物質(zhì)有水、氮源、碳源、無機鹽類、生長因子。2．2．2細菌生長繁殖的條件營養(yǎng)物質(zhì)細菌生長繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)如前述。此外，尚需其他一些條件。酸堿度大多數(shù)細菌最適酸堿度為PH6.8-7.2，此時酶活性較強，生長旺盛。個別細菌在堿性環(huán)境下生長良好，如霍亂弧菌。溫度不同種類的細菌，如其最適生長溫度相差較大。多數(shù)為嗜溫菌（在15~40℃均能生長）。寄生在人體的細菌即以宿主體溫（37℃）為適宜生長的溫度，因此實驗室采用37℃培養(yǎng)細菌。氣體與細菌生長有關(guān)的氣體主要是氧氣和二氧化碳。一般細菌在代謝中產(chǎn)生的二氧化碳即可滿足其需要。2．2．4細菌的生長繁殖細菌繁殖的方式與速度細菌通常以簡單的二分裂方式行無性繁殖。在適宜條件下，多數(shù)細菌繁殖很快，每20~30min分裂一次（一代），菌數(shù)即增長一倍，經(jīng)過18~24h后，可形成肉眼可見的群體。但細菌不可能始終保持這樣的速度持續(xù)繁殖，因為受到營養(yǎng)物質(zhì)的消耗或毒性代謝產(chǎn)物累積的限制，當培養(yǎng)到一定時間生長率即下降，以致完全終止。也有少數(shù)種類的細菌繁殖較慢，如結(jié)核桿菌增殖一代，約需18h。第三章微生物污染藥品的途徑及殺滅方法3.1污染藥品的途徑3.1.1藥物原料主要是指植物類藥材，這類藥材不僅直接帶有微生物和活螨，且有利于微生物和活螨生長繁殖。3.1.2各種輔助材料如水、蜂蜜、淀粉等常用輔料均存在一定數(shù)量的某種微生物。3.1.3制藥工具如：藥篩、粉碎機、混合機、制丸機、壓片機及各種盛裝藥物的容器等均有可能帶入微生物。3.1.4環(huán)境空氣空氣中含有許多微生物，塵埃越多微生物也越多，故需凈化空氣。3.1.5包裝材料裝藥用的玻璃瓶、塑料瓶、塑料袋、包裝紙等若不經(jīng)消毒和處理，均有可能帶入某些微生物。3．2滅菌方法自然界多種物理、化學、生物學因素可對細菌產(chǎn)生不同的影響。通?？衫闷鋵毦牟焕蛩?，以達到消毒、滅菌和治療的目的。滅菌是指用物理或化學方法殺滅物體上所有的微生物（包括致病的和非致病的、細菌繁殖體和芽胞）。消毒是指殺死物體上病原微生物的方法，但不一定殺死所有的生物。具有消毒作用的藥物稱為消毒劑。防腐或稱抑菌，阻止或抑制微生物生長繁殖，以防止物品的腐敗，但不一定殺死微生物。用以防腐的藥物稱為防腐劑。有的化學藥品在高濃度時可為消毒劑，低濃度時即為防腐劑(乙醇)。無菌是指沒有活菌存在的意思。防止細菌進入機體或物體的一系列操作方法稱無菌技術(shù)（或無菌操作）。3．2．1物理滅菌法熱力滅菌是常用而可靠的滅菌方法，包括干熱滅菌和濕熱滅菌。濕熱滅菌可引起菌體蛋白質(zhì)變性和凝固，以及核酸降解，濕熱并可引起細胞的損傷，致使K+等物質(zhì)漏出。干熱滅菌除使蛋白質(zhì)變性外，由于電解質(zhì)濃縮也可對細菌產(chǎn)生毒性作用。細菌對熱力的抵抗力可由于細菌種類、發(fā)育時期及有無芽胞的不同而異。熱力滅菌法種類設(shè)備及要求效果用途干熱滅菌焚燒法燃燒或在火焰上燒灼滅菌廢棄的污物、尸體、干烤法干烤箱，160～170℃，1～2h滅菌玻璃器皿等濕熱滅菌煮沸法煮沸鍋，100℃，5～10min消毒手術(shù)器械、注射器間歇滅菌法流動蒸氣滅菌器或蒸籠，100℃，15～30min,移入37℃過夜，每日一次連續(xù)三日滅菌不耐高溫（100℃以上）的物品巴氏消毒法加熱61.1-62.8℃,30mim消毒消毒牛奶、酒精高壓蒸氣滅菌法高壓蒸氣滅菌器，通常蒸氣壓為102.97Kpa，（1.05Kg/cm2），溫度121.3℃,15-30min滅菌耐高溫物品、如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、敷料，手術(shù)衣帽、手術(shù)器械、注射器等高壓蒸氣滅菌法是滅菌效果最徹底的方法。高壓蒸氣滅菌器是一密封的蒸鍋，蒸氣不能外溢，隨著蒸氣壓力增加，水的沸點上升器械內(nèi)溫度升高，器內(nèi)溫度升高，殺菌力也大為增強，通常在102.97kPa(1.05Kg/cm2)的壓力下，溫度可達成121.3℃，維持15~30min，可殺死一切微生物，包括細菌的芽胞。凡耐高溫和不怕潮濕的物品均可用此法滅菌。低溫細菌對寒冷有較強的耐受性，只有少數(shù)病原菌如腦膜炎球菌、流感桿菌耐受性較低。在低溫條件下，細菌的代謝緩慢，但仍能保持生命，一旦溫度等條件適宜，又可恢復(fù)繁殖。因此一般細菌菌種常保存于冰箱（0~4℃）中。此外，應(yīng)用冷凍真空干燥法更適于長期保存菌種和病毒。紫外線紫外線的波長在240~280nm時殺菌力最強，尤其在波長260nm，部分細菌的DNA吸收最多。紫外線主要是使DNA的同一股上相鄰的嘧啶之間形成共價鍵，產(chǎn)生嘧啶雙聚體，干擾正常堿基的配對導(dǎo)致細菌變異或死亡。但紫外線穿透力較弱，只適用于空氣和物體表面的消毒。人工紫外燈常用于手術(shù)室、傳染病房、燒傷病房和無菌室的空氣消毒。3．2．2化學因素對細菌的影響許多化學藥物能抑制細菌的生長繁殖或殺死細菌，廣泛用作消毒劑、防腐劑或化學療劑。（1）消毒防腐劑的作用原理：消毒防腐劑的種類很多，其殺菌或抑菌機理因其種類而不同：①使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，如重金屬離子容易和帶陰電荷的細菌（主要是菌體蛋白質(zhì)）相吸附，使之變性或沉淀，酒精、石炭酸、甲醛、酸、堿等或使蛋白質(zhì)脫水變性或與蛋白質(zhì)結(jié)合，使之變性凝固。②干擾細菌的酶系統(tǒng)，如高錳酸鉀、過氧化氫等氧化劑，以及重金屬離子能與細菌酶蛋白的-SH基結(jié)合，使之失去酶活性，導(dǎo)致細菌代謝功能發(fā)生障礙而死亡。③改變細胞膜的通透性，如表面活性劑能提高膜的滲透作用，一些重要的代謝物質(zhì)自細胞滲出，引起死亡。如酚類即能破壞細胞膜，使胞內(nèi)組分漏出。（2）常用消毒防腐劑的種類、濃度和用途類別名稱常用濃度用途備注重金屬鹽類紅汞.20%水溶液皮膚粘膜小創(chuàng)傷消毒硫柳汞0.01%0.1%①生物制品防腐②皮膚、手術(shù)部位消毒硝酸苯汞先配成1/1500高壓滅菌，稀釋成0.002%生物制品防腐硝酸銀1%新生兒滴眼，預(yù)防淋球菌感染有腐蝕性氧化劑高錳酸鉀0.1%皮膚、尿道消毒，水果、蔬菜消毒過氧化氫3%口腔粘膜消毒，沖洗傷口（厭氧菌感染）過氧乙酸0.2~0.5%塑料、玻璃、人造纖維水泄消毒及洗手20%濃度的市售品無爆炸危險，原液對皮膚、金屬有強烈腐蝕性鹵素及其化合物漂白粉10~20%每升水加5~10mg①排泄物、地面、廁所消毒②飲水消毒不能用于衣物、有色金屬的消毒氯胺0.2~0.5%水溶液0.1~0.2%①室內(nèi)空氣及表面消毒（噴霧）②浸泡衣服碘酒2~2.5%皮膚消毒不能與紅汞同用。刺激性大涂后用酒精擦拭醇類酒精70~75%皮膚、體溫計消毒消毒力不強，對芽胞無效醛類甲醛10%浸泡物體表面消毒蒸氣消毒：10%溶液加等量水，蒸發(fā)，密閉房間6～24h；或加半量高錳酸鉀，產(chǎn)生黃色濃煙，消毒房間酚類石炭酸來蘇兒3~5%地面、家具、器皿表面消毒，2%皮膚消毒殺菌力強，有特殊氣味表面活性劑（季胺鹽類）新潔爾滅0.05~0.1%外科手術(shù)洗手，皮膚粘膜消毒，浸泡手術(shù)器械對芽胞無效；遇肥皂及其他洗滌劑作用減弱杜滅芬（消毒寧）0.05~0.1%皮膚創(chuàng)傷沖洗，金屬器械、棉織品、塑料等消毒遇肥皂或洗滌劑效果減弱乙烷洗必泰0.02~0.05%0.01~0.025①術(shù)前洗手（浸泡5min）②腹腔、膀胱及陰道沖