醫(yī)院科研系統(tǒng)講座WB總蛋白內(nèi)參定量

免疫印跡總蛋白內(nèi)參定量與免染技術(shù)

Presenter2WesternBlot定量歸一化CBA目標(biāo)蛋白CBA內(nèi)參100100200光密度讀值歸一化因子1:1:210050200光密度讀值看上去10050100實(shí)際上3常用看家蛋白作為內(nèi)參不一定可靠4看家蛋白的線性較差CoomassietotalproteinmeasurementGAPDHJProteomeRes.2011Mar4;10(3):1416-9.5DittmerAandDittmerJBeta-actinisnotareliableloadingcontrolinwesternblotanalysisElectrophoresis(2006).27,2844–2845.稀釋抗體濃度、減少孵育時(shí)間和曝光時(shí)間都無助于actin信號(hào)的最終過曝。SuzukiO,KouraM,NoguchiY,Uchio-YamadaK,MatsudaJUseofsamplemixturesforstandardcurvecreationinquantitativewesternblots.JExpAnim(2011).60,193–196.Tubulin信號(hào)在不同上樣量情況下都保持了類似的強(qiáng)度。

看家蛋白線性較差6看家蛋白在某些情況下表達(dá)不恒定Rocha-MartinsM,NjaineB,SilveiraMSAvoidpitfallsofinternalcontrols:validationofreferencegenesforanalysisbyqRT-PCRandwesternblotthroughoutratretinaldevelopment.PLoSOne(2012).7,e43028.大鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的不同階段，Tubulin和actin的表達(dá)量變化很大。GreerS,HoneywellR,GeletuM,ArulanandamR,RaptisLHousekeepinggenes:expressionlevelsmaychangewithdensityofculturedcells.JImmunolMethods(2010).355,76–79.NIH3T3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過程中Tubulin和GAPDH隨細(xì)胞濃度變化差異很大。7AldridgeGM,PodrebaracDM,GreenoughWT,WeilerIJTheuseoftotalproteinstainsasloadingcontrols:analternativetohigh-abundancesingle-proteincontrolsinsemi-quantitativeimmunoblotting.JNeurosciMethods(2008).172,250–254.Vigels?A,DybboeR,HansenCN,DelaF,HelgeJW,GuadalupeGrauA.GAPDHandβ-actinproteindecreaseswithaging,making

StainFreetechnologyasuperiorloadingcontrolinWesternblottingofhumanskeletalmuscle.JApplPhysiol(2015)118(3):386-94.總蛋白的線性及表達(dá)恒定性更佳8WhenthecomparingcellsreceiveddifferentchemicalordrugtreatmentthatmaycausechangesonHKPs--kinaseinhibitortreatmentNeurobiologyofDisease54(2013)280–288Whencellbehaviorandmorphologymaychangedramaticallyinatimecoursestudy–cellcyclestudyJ.Biol.Chem.

2011

286:

37483-37495.Whensubjectingsamplestogeneticmodifications–transformation,transfection,transgenicmodels,KnockoutsTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVOL.287,NO.6,pp.3733–3750,February3,2012THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVOL.286,NO.35,pp.30662–30669,September2,2011從2010年起，JBC超過200篇文章使用了總蛋白代替看家蛋白作為WB內(nèi)參！總蛋白作為WB內(nèi)參的文獻(xiàn)越來越多9被審稿人要求使用總蛋白作為內(nèi)參10審稿人對(duì)WB數(shù)據(jù)的要求越來越高JCLININVEST（IF=13）編委Ushma評(píng)審western數(shù)據(jù)時(shí)的關(guān)鍵問題V3免染W(wǎng)esternBlot流程11蛋白分離

15分鐘TGX膠電泳凝膠蛋白可視化

1分鐘紫外激活成像蛋白轉(zhuǎn)印

7分鐘TBT轉(zhuǎn)印確認(rèn)轉(zhuǎn)印

1分鐘印跡膜成像

gelandblot蛋白定量

總蛋白內(nèi)參歸一化Stain-freeimageofpre-transfergelStain-freeimageofpost-transfergelStain-freeimageoftheblotChemiimageoftargetproteinTotalproteinnormalization12V3免染W(wǎng)esternBlot流程動(dòng)畫演示13ABCD

-tubulinGAPDH

-actin5040302010Stainfreeblotimage504030201050403020105040302010免染總蛋白的線性比看家蛋白更優(yōu)異Action、Tublin、GAPDH表達(dá)豐度高化學(xué)發(fā)光檢測(cè)靈敏度高化學(xué)發(fā)光為非線性反應(yīng)14總蛋白做定量歸一化的定量結(jié)果更可靠15總蛋白做定量歸一化的定量結(jié)果更可靠?jī)煞N不同培養(yǎng)條件下HCT116中c-myc的表達(dá)量變化（瞬轉(zhuǎn)某個(gè)基因之后）以actin為內(nèi)參，c-myc的表達(dá)量變化在兩種培養(yǎng)條件下變化趨勢(shì)不一致16總蛋白做定量歸一化的定量結(jié)果更可靠以TPN來定量，c-myc在兩種培養(yǎng)條件下的變化趨勢(shì)一致TPN定量得出了與HKP定量不同的結(jié)論，但是與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，并符合實(shí)驗(yàn)者預(yù)期17臺(tái)灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝移植病例肝移植后Beta-Actin表達(dá)不恒定Stain-Free更能準(zhǔn)確顯示每個(gè)泳道的真實(shí)上樣量總蛋白比Actin能更準(zhǔn)確反映泳道上樣量18總蛋白比Actin作為內(nèi)參定量更準(zhǔn)確數(shù)據(jù)：四川大學(xué)華西再生實(shí)驗(yàn)室19以Actin為內(nèi)參對(duì)VEGF表達(dá)定量的結(jié)果有2點(diǎn)疑問：三個(gè)Control樣品中的VEGF表達(dá)量差異很大梗死1的VEGF表達(dá)應(yīng)較Control有較大上調(diào)，但是Actin的內(nèi)參定量并未顯示該趨勢(shì)

以免染總蛋白為內(nèi)參對(duì)VEGF表達(dá)進(jìn)行定量的結(jié)果基本符合樣品的實(shí)際情況（Control組表達(dá)量近似），并符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期（梗死1的VEGF表達(dá)量會(huì)上調(diào)）。總蛋白比Actin作為內(nèi)參定量更準(zhǔn)確20“IenjoyedusingtheV3WesternWorkflow.Itiseasyandfast.Thestain-freeisfantastic!Itisconvenientandrequireslittleextrawork.Iwillcontinuetousestain-freeapproachesasanalternativetohousekeepingproteins.”我非常喜歡V3的操作流程，它簡(jiǎn)單快速。免染膠非常了不起。我將繼續(xù)用免染的方法來代替看家蛋白定量。

Fur-ChiChen,TennesseeStateUniversity,US用戶聲音21

“WehavebeenroutinelyusingtheStainFreegelsandChemiDocMPforimaginggelsaswellasnormalizingwesternblots.

WeprimarilyusedSyproOrangeinthepast,butthestainfreegelshaveessentiallyreplacedthatneed,aswellassavinganhourofpost-staining.”“我們已經(jīng)將免染膠和ChemiDocMP作為westernblot定量的常規(guī)方法。我們之前曾采用SyproOrange，但是現(xiàn)在免染技術(shù)已經(jīng)完全取代了SyproOrange?！?RyanB.JensenPh.D. AssistantProfessorofTherapeuticRadiology用戶聲音22Ryan發(fā)表的文獻(xiàn)中使用免染總蛋白做內(nèi)參

23耶魯醫(yī)學(xué)院Ryan的采訪視頻Over90stain-freeTPNpapersbyMay15,201525Mol.Cell.Biol.2014,34(1):96PLoSONE2013,8(12):e81784文獻(xiàn)中的免染總蛋白內(nèi)參數(shù)據(jù)26DevelopmentalBiologyVolume376,Issue2,15April2013,Pages171–186文獻(xiàn)中的免染總蛋白內(nèi)參數(shù)據(jù)27MolecularandCellularBiologyDecember2014,Volume34,Issue24文獻(xiàn)中的免染總蛋白內(nèi)參數(shù)據(jù)28MolCellProteomics2014Nov20;13(11):2975-85.Epub2014Jul20.文獻(xiàn)中的免染總蛋白內(nèi)參數(shù)據(jù)29SumoylationofRap1mediatestherecruitmentofTFIIDtopromotetranscriptionofribosomal