微生物的大小測定與顯微計(jì)數(shù)

微生物實(shí)驗(yàn)PAGEPAGE1實(shí)驗(yàn)二微生物的大小測定與顯微計(jì)數(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物細(xì)胞大小的方法。了解血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造及計(jì)數(shù)原理。掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。二實(shí)驗(yàn)原理酵母菌大小測定在顯微鏡下，測微尺可完成對微生物大小的測定。測微尺包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺是一塊放入目鏡中的圓形玻片，在玻片中央把10mm的長度刻成100等分，用于測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞圖像。測量前，需先用鏡臺測微尺校正。鏡臺測微尺是專門用來校正目鏡測微尺的。微生物數(shù)量的測定圖一血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（圖一）是一塊特制的載玻片，薄片上有4條槽構(gòu)成3個平臺，中間較寬的平臺又被一短槽隔成兩半，每一邊平臺各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為9個大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。圖一血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造圖二血細(xì)胞計(jì)數(shù)室構(gòu)造（16×25）計(jì)數(shù)室（圖二）的刻度有兩種：一種大方格分為16個中方格，每個中方格分成25個小方格；一種大方格分成25個中方格，中方格分成16個小方格。每個大方格都是400個小方格，邊長為1mm，面積1mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。圖二血細(xì)胞計(jì)數(shù)室構(gòu)造（16×25）三實(shí)驗(yàn)儀器、材料和用具實(shí)驗(yàn)用具：載玻片、蓋片、200μl移液器及tip、擦鏡紙、裝有蒸餾水的洗瓶。實(shí)驗(yàn)儀器：普通生物顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、血球計(jì)數(shù)板、手動計(jì)數(shù)器;菌種：釀酒酵母（200rpm，28℃，24h，稀釋20倍四實(shí)驗(yàn)步驟酵母菌大小測定（1）目鏡測微尺的校正在100倍鏡下，使目鏡測微尺的目鏡和鏡臺測微尺某一個區(qū)域內(nèi)兩線完全重合。計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺和鏡臺測微尺的格數(shù)（格數(shù)必須是整數(shù)）。（2）細(xì)胞大小的測定將稀釋40倍的少量的酵母培養(yǎng)液涂在載玻片上，用蓋玻片推開，放在載物臺上。用100倍鏡觀察，用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體的長、寬各占幾格。測定20個菌體，統(tǒng)計(jì)計(jì)算。（3）測定完畢后，將目鏡測微尺和物鏡測微尺擦拭干凈包好歸還。微生物數(shù)量的測定菌液準(zhǔn)備：將啤酒酵母在28℃，100r/min培養(yǎng)8h。4鏡檢計(jì)數(shù)室：加樣前，對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室鏡檢，若有污物需要清洗，干燥后使用。加樣品：將血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中間平臺蓋上蓋玻片，用無菌水吸管將搖勻的啤酒酵母菌懸液由蓋玻片的邊緣滴一小滴，讓菌液靠毛細(xì)滲透作用自動進(jìn)入到計(jì)數(shù)室。顯微鏡計(jì)數(shù)：加樣后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡的載物臺上，靜置1min后，用4倍鏡找到計(jì)數(shù)室，再換10倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。對兩個計(jì)數(shù)室各計(jì)數(shù)一次。酵母菌計(jì)數(shù)完畢后，馬上將其用洗瓶沖洗，自然晾干，或者用擦鏡紙輕輕擦干。重新加樣：按照前面的步驟再計(jì)數(shù)5次。利用公式計(jì)算出血細(xì)胞的數(shù)量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.酵母菌大小測定已知鏡臺測微尺每格10μm，所以根據(jù)下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的實(shí)際長度：物鏡倍數(shù)（目鏡10×）目鏡測微尺格數(shù)（小格）鏡臺測微尺格數(shù)（小格）目鏡測微尺每格長度(μm)100×111．011.00.99表一目鏡測微尺標(biāo)定結(jié)果.菌號12345678910目鏡測微尺格數(shù)（長軸）9.18.58.08.98.16.39.27.27.08.5目鏡測微尺格數(shù)（短軸）6.06.06.98.06.05.37.26.86.86.1菌號11121314151617181920目鏡測微尺格數(shù)（長軸）6.97.17.18.08.09.07.010.09.07.0目鏡測微尺格數(shù)（短軸）5.06.55.27.86.285.18.97.05.2表二酵母菌大小的測定結(jié)果(100×)經(jīng)計(jì)算得：酵母菌長軸平均值7.995×0.99μm＝7.92μm；酵母菌短軸平均值6.500×0.99μm＝6.44μm酵母菌體積平均值=4πabc/3=172.04μm3隨機(jī)誤差使測量值具有一定的分散性，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差可用s表征，s可以用貝塞爾公式算出：其中n在這次實(shí)驗(yàn)中為20計(jì)算得μmμm不確定度置信度為0.95時，查表，t=2.093，則=0.468所以μm；μm綜上，酵母菌長軸7.92±0.47μm酵母菌短軸6.44±0.52μm酵母菌懸液顯微計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)各中格中菌數(shù)總細(xì)菌數(shù)稀釋倍數(shù)平均值菌數(shù)個/ml左上右上右下左下中119121316157540661.3×108212131710106231210141213614171021191986514115912516891616166577157484185755931919141414288910121517101872116181815137012141723181789表三用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對酵母菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果酵母菌體積含量=酵母菌細(xì)胞數(shù)/ml單個細(xì)胞體積=/ml172.04μm3=2.3%六實(shí)驗(yàn)總結(jié)和分析數(shù)據(jù)分析：（1）查資料得，釀酒酵母的細(xì)胞為球形或者卵形，直徑5–10μm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合。（2）從顯微計(jì)數(shù)測量結(jié)果（表三）分析：通過計(jì)算，發(fā)現(xiàn)其他組的標(biāo)準(zhǔn)偏差都在1到5個之間，但第9組標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到了6.1個，說明菌液分布不均勻，中間一格數(shù)目很多，也許是因?yàn)闆]有搖勻，或者通過毛細(xì)現(xiàn)象吸入裝片下時不夠均勻。比較可得，第7、8組數(shù)據(jù)都偏小，這兩組數(shù)據(jù)是一起測量的，而且測量前可能是搖勻了菌液的，所以懷疑是上一次洗了計(jì)數(shù)板后沒有晾干，在兩個計(jì)數(shù)室區(qū)域之間的小溝里有水殘留，后來加入菌液時被稀釋。關(guān)于結(jié)果：我的結(jié)果和旁邊組的人差異很大，除了拿到的菌液可能有差異外，我覺得個人主觀因素應(yīng)該也有一定影響。比如測量長度時候選擇細(xì)胞，雖然說要選取各種大小的細(xì)胞測量，但個人可能選擇到的細(xì)胞大小不同，而且讀數(shù)時也會因人而異；計(jì)數(shù)時也是，對于出芽酵母，老師給的標(biāo)準(zhǔn)是大于母細(xì)胞一半就算一個細(xì)胞，但是每個人的判斷是不一樣的，有的和母細(xì)胞大小一半差不多的細(xì)胞，有人會計(jì)數(shù)，有人就不會計(jì)。關(guān)于操作：測量大小時，要把目的細(xì)胞中心放在視野正中，這樣調(diào)節(jié)目鏡測微尺測量長短軸會很方便，并使細(xì)胞的一邊與一條刻度尺相切，以減少讀數(shù)誤差。調(diào)節(jié)觀察顯微計(jì)數(shù)時，要把聚光器調(diào)低，光線調(diào)暗，這樣比較容易在一個焦平面上看到計(jì)數(shù)室和酵母細(xì)胞。計(jì)數(shù)過程中，可以調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，防止遺漏不同空間位置的細(xì)胞。吸取溶液前搖勻，可以用吸管吹吸幾次再取。滴加菌液時不要太多，恰好滲入即可。七思考題1．根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)體會，說明計(jì)數(shù)板的誤差主要來自哪些方面？計(jì)數(shù)板上殘留著上一次計(jì)數(shù)的酵母清洗計(jì)數(shù)板后沒有晾干就再次使用酵母菌液在稀釋、分裝過程中可能產(chǎn)生誤差溶液不均勻造成的誤差過多溶液滲入計(jì)數(shù)器，并且細(xì)胞沉積統(tǒng)計(jì)組數(shù)有限造成的隨機(jī)誤差計(jì)數(shù)的誤差，如忽略體積較小的酵母菌、計(jì)算了很小的出芽、邊緣細(xì)胞計(jì)數(shù)重復(fù)或漏記滴加太多使得蓋玻片飄起來，體積不準(zhǔn)確，錯誤判斷酵母芽體大小2．顯微測微尺上的刻度大小和放大倍數(shù)會影響到測量結(jié)果嗎?刻度大小會影響，因?yàn)榭潭却笮『蜏y量精度直接相關(guān)。如果一個酵母連一格都占不到，測量結(jié)果肯定不會準(zhǔn)確。放大倍數(shù)也有影響，雖然理論上說，測定的結(jié)果應(yīng)該是基本上相同的，因?yàn)檎鎸?shí)值是不變的。但由于人眼的精度限制，在低倍物鏡下觀察到的菌體可能比較小，甚至都不到目鏡測微尺一小格，這時測量的偏差會比較大。所以在實(shí)驗(yàn)中選用放大倍數(shù)比較大的物鏡，在能清晰地觀測菌體的情況下進(jìn)行測量。3．假設(shè)酵母菌是標(biāo)準(zhǔn)的橢球體，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試推算酵母菌培養(yǎng)液中酵母菌的體積含量。酵母菌長軸平均值7.995×0.99μm＝7.92μm酵母菌短軸平均值6