DB21-T 2981-2018日本落葉松SRAP分析技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01

B60

備案號：60599-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T2981—2018

日本落葉松SRAP分析技術(shù)規(guī)程

TechnicalRegulationsforSRAPanalysisinLarixkaempferi

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省林業(yè)廳提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王騫春、馮健、于世河、卜鵬圖、陸愛君、汪成成、張素清、陳罡、楊鶴、高英

旭、顏廷武、崔雪、丁彪、潘福民、鄭穎、王嘉、高宇、陳波、李程、趙濟(jì)川。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A，附錄B，附錄C和附錄D為規(guī)范性附錄。

III

DB21/T2981—2018

日本落葉松種子園遺傳多樣性的SRAP分析技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以日本落葉松SRAP分析的定義、術(shù)語、分析原理、儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)引物、反應(yīng)程序。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于日本落葉松的SRAP分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T13016-2009標(biāo)準(zhǔn)體系表編制原則和要求

DB21/T2589-2016東部白松種源相關(guān)序列多態(tài)性（SRAP）分子鑒定實(shí)驗(yàn)方法

3定義與術(shù)語

下列定義與術(shù)語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1相關(guān)序列多態(tài)性sequence-relatedamplifiedpolymorphism;SRAP

利用1對引物設(shè)計(jì)對開放閱讀框（openreadingframes，ORFs）進(jìn)行擴(kuò)增，因個體不同以及物種

的內(nèi)含子、啟動子與間隔序列長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。

3.2引物primer

一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進(jìn)行延伸

的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈。

3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction;PCR

在耐熱DNA聚合酶作用下，于體外快速大量特異擴(kuò)增待定DNA序列的方法。

3.4引物擴(kuò)增多態(tài)性primeramplifiedpolymorphism

1對引物在兩個或兩個以上不同材料基因組DNA之間擴(kuò)增，得到數(shù)目不同或長度不同的DNA片段。

4儀器和設(shè)備

4.1PCR擴(kuò)增儀。

DB21/T2981—2018

4.2瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。

4.3非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)。

4.4凝膠成像系統(tǒng)和照相系統(tǒng)。

4.5超純水系統(tǒng)。

4.6低溫高速冷凍離心機(jī)。

4.7超微量紫外/可見分光光度計(jì)。

4.8高壓滅菌鍋。

4.9液氮罐。

4.10超低溫冰箱。

4.11高壓電泳儀及配套電泳槽。

4.12移液器。

5引物

引物相關(guān)信息見附錄A。

6試劑與溶液

6.1主要常規(guī)試劑見附錄B。

6.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑見附錄C。

6.3銀染試劑見附錄D。

7實(shí)驗(yàn)程序

7.1實(shí)驗(yàn)材料

選用日本落葉松新鮮針葉提取基因組DNA，選取適量樣品，裝入凍存管，液氮速凍，置冰箱（-70℃）

中保存?zhèn)溆谩?/p>

7.2DNA的提取

7.2.1取0.5g洗干凈的針葉，用滅菌剪刀剪成小段置1.5mL離心管中(約至0.1刻度線)。加適量

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和VC（抗壞血酸），再向離心管中加入液氮后用塑料研磨杵將針葉研磨成粉

末。

DB21/T2981—2018

7.2.2加入1ml0℃預(yù)冷的CTAB-free提取液，混勻，0℃冰浴10min，期間輕柔顛倒2次-3次，在

4℃下10000r/min離心10min，棄上清。若上清液黏稠，用CTAB-free提取液清洗1次。

7.2.3加入650μL65℃預(yù)熱的4×CTAB提取液，用無菌槍頭小心將其混勻，65℃水浴30min。

7.2.4加入等體積的氯仿:異戊醇(V:V)=24:1的抽提掖，輕柔顛倒離心管10min，使其混勻，10000r/min

離心10min。然后用去尖的移液器吸頭小心吸取450μL上清液至另一離心管中，重復(fù)此步驟1次-2

次，至白色中間層消失為止。

7.2.5加入2倍體積的冰冷無水乙醇，顛倒混勻，出現(xiàn)絮狀沉淀，-20℃放置2h。10000r/min離心10

min，棄上清液。

7.2.670%乙醇清洗2遍，風(fēng)干后加入100μL滅菌TE緩沖液溶解沉淀。

7.3DNA濃度的檢測和定量

用TE緩沖液配制lμg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的λ-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，

各取3μLλ-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液和3μL7.1中提取的未知濃度DNA溶液，在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，穩(wěn)

壓90V，電泳緩沖液為1×TBE，325nm紫外燈下觀察，照相，通過與標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光進(jìn)行比較估測未知

DNA的濃度。

將8.2中提取的DNA溶液取10μL后，在1.5mL離心管中用TE稀釋200倍，放入石英比色杯中，用紫

外分光光度計(jì)檢測，記下其在260nm和280nm的光密度值（OD值），按公式（1）計(jì)算出DNA的濃度及

OD260和OD280的比值。OD260/OD280在1.8～2.0之間。

D=OD260×n×50/1000

式中：

D—DNA的濃度，單位為納克每微升（μg/μL）；

OD260—260nm下的光密度值；

n—稀釋倍數(shù)。

7.4PCR反應(yīng)

7.4.1PCR反應(yīng)體系

20μl反應(yīng)體系中，模板DNA為120ng，引物濃度為0.3μmol/L，dNTPs濃度為0.15mmol/L，Mg2+

濃度為1.5mmol/L，Taq酶濃度為1.0U。

7.4.2PCR反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性5min；前5個循環(huán)：94℃變性1min，37℃退火1min，72℃延伸1min；后40個循

環(huán)：94℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，最后4℃保存。

7.4.3PCR產(chǎn)物的處理

PCR結(jié)束后，于20μL的反應(yīng)體系中加入4μL的上樣緩沖液，搖晃混勻后，備用。

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7.5聚丙烯酰胺凝膠的制備

7.5.1玻璃板的清洗

用洗滌劑及抹布擦洗玻璃板（長板和短板），隨后用自來水沖洗干凈，再將玻璃板用蒸餾水沖洗2

次，最后用無屑紙巾沾取無水乙醇擦拭2遍，置于通風(fēng)櫥內(nèi)垂直晾干待用。

7.5.2膠槽裝配

7.5.2.1玻璃板的固定

將長板玻璃板平鋪于通風(fēng)櫥內(nèi)，邊條擦拭后置于玻璃板兩側(cè)，隨后用短板玻璃板整齊地壓蓋住，確

認(rèn)邊條與兩玻璃板均對齊后，將其放入封膠框中并用夾子固定在制膠板上。

7.5.2.2封膠

配制1%的瓊脂糖凝膠，徹底煮沸后用膠頭滴管吸取，沿底邊從左至右緩緩灌注入封膠框中，避免

出現(xiàn)氣泡，待瓊脂糖凝膠完全漫過玻璃板底部，停止灌注，待其室溫凝固后進(jìn)行下一步操作。

7.5.3丙烯酰胺膠的配制

在50mL8%非變性聚丙烯酰胺儲備液中加入100μL10%過硫酸銨和200μL四甲基乙二胺

（TEMED)，迅速輕輕混勻。

7.5.4灌膠

將固定有封好玻璃板的制膠板向后傾斜放置，配好的8%非變性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁緩

慢勻速倒入灌膠口中，避免出現(xiàn)氣泡，待膠剛要溢出灌膠口時停止灌膠，將梳子輕輕插入灌膠口中，室

溫凝固1h以上。

7.5.5上樣和電泳

待凝膠完全凝固后，將裝有凝膠的玻璃板輕輕從制膠板上取下，灌膠口向內(nèi)用夾子固定在電泳槽上，

使用1×TBE緩沖溶液灌注電泳儀的上下兩槽，使下槽溶液漫過封膠框，上槽溶液漫過灌膠孔。垂直緩

慢將梳子從灌膠口中拔出，并用1×TBE緩沖溶液清洗和整理樣品槽。使用200μL移液器從左至右逐個

對點(diǎn)樣孔進(jìn)行吹打，直至點(diǎn)樣孔內(nèi)無碎膠、氣泡以及其他雜質(zhì)。取5μL處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，

并在膠板的一側(cè)或適當(dāng)位置的樣品槽中加入4μL的DNAMarker(DL2000Marker)作為對照，電泳在

200V穩(wěn)壓，電流300mA條件下進(jìn)行，電泳時間約為2.5h～3h。

7.5.6卸膠

電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，將上槽中1×TBE緩沖液放出，取下固定的夾子，將玻璃板水平放置，起膠

鏟一側(cè)沿灌膠口邊緣緩慢撬起，將緊貼有凝膠的玻璃板放入裝有雙蒸水的洗膠盤中，使凝膠與玻璃板分

離，取出玻璃板，放凈雙蒸水。

7.6銀染

DB21/T2981—2018

7.6.1固定

將取出的凝膠小心放入裝有1L新配制的10%冰乙酸（固定/終止液）的塑料方盒中，置于水平搖

床上80r/min輕搖10min。

7.6.2漂洗

將膠小心轉(zhuǎn)入雙蒸水中漂洗2次，每次2min，放凈雙蒸水。

7.6.3染色

在新配好的500mL硝酸銀溶液中加入1.6mL37%甲醛溶液，充分混勻后沿一角倒入裝有凝膠的方

盒中，水平搖床上80r/min輕搖10min后，放凈染色液。

7.6.4沖洗

在方盒中加入1L雙蒸水，脫色搖床上80r/min輕搖30s，倒凈雙蒸水。

7.6.5顯影

將2mL37%甲醛溶液加入提前4℃預(yù)冷的500mL氫氧化鈉溶液中，充分混勻后沿一角倒入方盒

中，水平搖床上80r/min輕搖至清楚條帶顯現(xiàn)。

7.6.6定影

將膠小心取出，用雙蒸水沖洗一次后迅速放入10%冰乙酸中，水平搖床輕搖3min～5min，放凈固

定液。

7.6.7漂洗

在雙蒸水中漂洗2次，每次2min。

7.6.8觀測

將凝膠輕輕放在白的透明的日光燈觀測箱上，用玻璃棒鋪平凝膠并趕出氣泡，觀察和記錄電泳結(jié)果，

用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照；或用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。

7.7譜帶記錄

選取電泳圖上清晰、易于辨認(rèn)的多態(tài)性條帶進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）

計(jì)算出個擴(kuò)增條帶相應(yīng)的DNA片段分子量大?。ń浦担?，以SRAP引物組合的名稱加上DNA片段分子量大

小為后綴對條帶進(jìn)行命名，并分別用“1”和“0”代表“有”帶和“無”帶的方法仔細(xì)記錄，獲得DNA二維數(shù)據(jù)

矩陣。

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

SRAP（相關(guān)序列多態(tài)性）標(biāo)記引物序列

表A.1所用SRAP（相關(guān)序列多態(tài)性）標(biāo)記引物序列

引物編號序列（5'→3'）引物編號序列（5'→3'）

me1TGAGTCCAAACCGGATAem1GACTGCGTACGAATTAAT

me2TGAGTCCAAACCGGAGCem2GACTGCGTACGAATTTGC

me3TGAGTCCAAACCGGAATem3GACTGCGTACGAATTGAC

me4TGAGTCCAAACCGGACCem4GACTGCGTACGAATTTGA

me5TGAGTCCAAACCGGAAGem5GACTGCGTACGAATTAAC

me6TGAGTCCAAACCGGTAAem6GACTGCGTACGAATTGCA

me7TGAGTCCAAACCGGTCCem7GACTGCGTACGAATTCAA

me8TGAGTCCAAACCGGTGCem8GACTGCGTACGAATTCTG

me9TGAGTCCAAACCGGTAGem9GACTGCGTACGAATTCGA

me10TGAGTCCAAACCGGTCTem10GACTGCGTACGAATTCAG

em11GACTGCGTACGAATTCCA

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BB

附錄B

（規(guī)范性附錄）

主要試劑的配置

B.10.5mol/LEDTA-二鈉（pH8.0）溶液

將18.61g乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA-2H2O）溶于80mLH2O中，加入氫氧化鈉（NaOH）調(diào)

節(jié)pH至8.0，用超純水定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。

B.21mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液

將24.22g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于160mL水中，用濃鹽酸（HCl）調(diào)劑pH至8.0，用超

純水定容至200mL，高壓滅菌，4℃保存。

B.35mol/LNaCl溶液

將58.44g氯化鈉（NaCl）溶于160mL水中，定容至200mL，高壓滅菌，4℃保存。

B.4CTAB-free緩沖液

CTAB-free緩沖液的成分為250mmol/LNaCl、200mmol/LTris-HCl（1mol/LpH8.0）和50mmol/L

EDTA（0.5mol/LpH8.0）。在600mL水中加入14.6gNaCl，攪動溶解后，加入200mL1mol/LTris-HCl

（pH8.0）、100mL50mmol/LEDTA（pH8.0），定容至1000mL，高壓滅菌，4℃保存。

B.54×CTAB提取緩沖液

4×CTAB提取緩沖液的成分為4%（質(zhì)量濃度）溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、100mmol/LTris-HCl

（1mol/LpH8.0）、20mmol/LEDTA（0.5mol/LpH8.0）和1.4mol/LNaCl（5mol/L）。在500mL去離

子水中加入40gCTAB，攪動溶解后。加入100mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）、40mL0.5mol/LEDTA

（pH8.0）和280mL5mol/LNaCl，定容至1000mL，高壓滅菌，4℃保存。

B.6TE（pH8.0）緩沖液

取1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.2mL，用水定容至100mL，高壓

滅菌，4℃保存。

B.7EB（1mg/mL）溶液

取0.05g溴化乙錠（EB）用50mL水溶解，用鋁箔或黑紙包裹容器，室溫保存，工作濃度

為1mg/mL。

B.810mol/LNaOH溶液

稱取80mg氫氧化鈉（NaOH），先用160mL水溶解后，在加水定容至200mL，高壓滅菌，室溫

保存。

B.90.8%瓊脂糖凝膠的配制

稱取0.8g電泳級瓊脂糖至于200mL三角瓶中，加入100mL1×TBE電泳緩沖液，在微波爐中熔化

至溶液透明（確保所有瓊脂糖顆粒均完全熔化），冷卻至50℃～60℃，加入EB（1mg/mL）溶液使其

終濃度為0.5μg/mL，混勻后倒入放好梳子（距底板約1mm）的載版上，凝膠厚度為3mm～5mm，待

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凝膠完全凝固后放入電泳槽中，然后向槽內(nèi)加入1×TBE稀釋緩沖液至液面剛好沒過膠版上表面。

B.106×DNA上樣緩沖液電泳(DNALordingBuffer)

6×DNALordingBuffer，其中含0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溴酚藍(lán)、0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲苯青、

30mmol/LEDTA、36%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甘油和ddH2O。使用時按照每5μLDNA樣品加入1μLDNA上樣緩沖液

的比例，混合DNA樣品和DNA上樣緩沖液，直接加到點(diǎn)樣孔即可。

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CC

附錄C

（規(guī)范性附錄）

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑

表C.140%丙烯酰氨（acrilamide）貯備液

成分用量備注

丙烯酰氨（acrilamide）380g用400mL去雙蒸水加熱溶解

甲叉雙丙烯酰氨（bis-acrilamide）20g用200mL去雙蒸水溶解

最終體積1000mL棕色瓶中室溫保存

表C.210%過硫酸銨（ammoniumpersulphate）溶液

成分用量備注

過硫酸銨（ammoniumpersulphate）1g

雙蒸水（ddH2O）10mL分裝后-20℃保存。

表C.310倍三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸緩沖液（10×TBE緩沖液）

成分用量備注

Tris堿（Trisbase）108g

硼酸（boricacid）55g

0.5mol/LEDTA（pH8.0）40mL用雙蒸水定容至1000mL

最終體積1000mL室溫保存

表C.48%非變性聚丙烯酰氨工作液

成分用量備注

40%丙烯酰氨貯備液10mL現(xiàn)用現(xiàn)配

10×TBE5mL

雙蒸水（ddH2O）35mL

10%過硫酸銨（ammoniumpersulphate）100μL

四甲基乙二酸（TEMED）200μL

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DD

附錄D

（規(guī)范性附錄）

銀染試劑

表D.1固定/脫色液

成分用量備注

冰乙酸（glacialaceticacid）100mL臨時配制

雙蒸水（ddH2O）900mL

表D.2硝酸銀（AgNO3）染色液

成分用量備注

硝酸銀（AgNO3）3g

37%甲醛（formaldehyde）1.6mL

雙蒸水（ddH2O）500mL臨時配制，避光室溫保存

表D.2氫氧化鈉（NaOH）顯影液

成分用量備注

氫氧化鈉（NaOH）10g用前在4℃冰箱預(yù)冷30min。

37%甲醛（formaldehyde）2mL

雙蒸水（ddH2O）500mL臨時配制，避光室溫保存

_________________________________

目次

前言..............................................................................IV

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3定義與術(shù)語.........................................................................1

4儀器和設(shè)備......................................................................