體內(nèi)藥分固相萃取

化學衍生化法固相萃取技術(shù)綴合物水解固相萃取技術(shù)SPE一.SPE概述二.SPE的類型三.SPE裝置與操作程序四.SPE的優(yōu)缺點五.SPE的應(yīng)用

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固相萃?。╯olidphaseextraction，SPE）是一種試樣預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來。SPE技術(shù)就是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的。

一、SPE概述SPE有兩種洗脫方式1、藥物先被保留，再用溶劑洗脫；2、藥物直接被洗脫二、固相萃取裝置及操作程序1、裝置篩板篩板

①活化吸附劑適當?shù)娜軇┝芟葱≈?，除雜質(zhì)；填料溶劑化

2、操作程序

②上樣抽真空，加壓或離心使樣品進入吸附劑；試樣溶劑強度不宜過高

③洗滌較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉。

④洗脫和收集較強的溶劑將目標化合物洗脫下來，收集。三、SPE類型1、親脂型：大孔吸附樹脂、親脂性鍵合硅膠2、親水型：硅膠、硅藻土、棉纖維等3、離子交換型4、新型固相萃取劑（一）親脂性鍵合硅膠固相萃取吸附劑：

以烷基、苯基、氰基為主，C18最常用適用于萃取、純化水基質(zhì)體液中疏水性藥物原理：

1.分析物中的CH鍵+硅膠表面官能團→吸附→極性溶液中的有機分析物→保留在SPE。

2.用非極性溶劑解吸吸附在固定相中的目標物質(zhì)。（二）大孔吸附樹脂固相萃取吸附劑:

苯乙烯與二乙烯共聚而成吸附性質(zhì)：

與烷基鍵合硅膠相似應(yīng)用：適用于吸附較大的分子，具有較高的的傳質(zhì)速率；不會對堿藥物產(chǎn)生強吸附（三）親水型固相萃取吸附劑：硅膠、硅藻土、棉纖維原理：分配原理，類似于LLE，樣品分布在表面積很大SPE支持物表面，有機溶劑與水相充分接觸，比LLE更易達到平衡。適于較親脂藥物與親水的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離萃取程序：樣品加到柱上→分布于支持物表面→用與水不混溶的有機溶劑洗脫較親脂藥物（四）離子交換樹脂固相萃取原理:離子交換及憎水吸附對于弱酸性藥物，在中性或堿性條件下用陰離子交換方法萃取，用水及有機溶劑（大多數(shù)用甲醇）清洗后，用酸性溶液洗脫。對于堿性藥物，反之。應(yīng)用：適用于高極性，可電離的藥物分類：陰離子交換和陽離子交換吸附劑：離子交換樹脂特點：回收率好，選擇性好，但是費時（五）新型固相萃取劑1、混合型吸附劑極性、非極性基團、離子交換基團或高分子樹脂混合使用使用范圍更廣，可用于各種化合物的萃取濃縮如以氯甲基化的高分子樹脂PS—DYB，即能同時萃取離子型和非離子型化合物如Waters的OasisHLB，不需活化，具有很寬的pH(1~12)范圍，特別適用于血漿、尿液等生物樣品。2、分子印跡吸附劑帶某一特異識別單體的聚合物，耐高溫，pH使用范圍寬，能從復(fù)雜的生物基質(zhì)中選擇性提取出微量分析物3、免疫萃取吸附劑利用抗體一抗原的相互作用，特異性識別與自身結(jié)構(gòu)相似的組分，從而與雜質(zhì)分離。四、SPE法的優(yōu)缺點優(yōu)點：缺點：引入雜質(zhì)少；避免乳化的形成；萃取率高，重現(xiàn)性較好；樣品用量少；柱子可棄，無污染；溶劑大多可與水混合，易于自動化。價格昂貴；技術(shù)要求高；批與批之間有差異；柱子易阻塞，影響分離效果，樣品須經(jīng)預(yù)處理。五、各固相萃取方法間的比較類型固相萃取劑萃取機理被萃取物回收率選擇性方便、省時性親脂型親脂性鍵合相硅膠大孔吸附樹脂憎水吸附較親脂或具較大親脂結(jié)構(gòu)中中中中很好好離子交換型離子交換樹脂離子交換及憎水吸附可成為帶電的形式好好差親水型硅膠硅藻土棉纖維分配作用（硅膠的吸附作用）較親脂好中中1）較親脂藥物用烷基鍵合相，堿性藥物用大孔樹脂

為佳2）較親水藥物且具有酸堿性，可電離，采用離子

交換樹脂3）較親水但不能解離，不易萃取，沉淀蛋白后直

接進樣萃取方法的選擇

例1、弱陰離子超高交聯(lián)樹脂固相萃取-高效液相色譜-紫外法測定人尿中高香草酸的含量高香草酸（HVA）

本實驗采用沉淀聚合和氨基修飾方法,合成了具有高比表面積吸附和離子交換雙重功能的弱陰離子超高交聯(lián)樹脂固相萃取填料。對尿液中的高香草酸進行選擇性的萃取富集,再用常規(guī)的高效液相色譜法(紫外檢測器)進行分析五、SPE法應(yīng)用固相萃取條件：淋洗液：

3mL水、3mL甲醇-水(6：4，V/V)洗脫劑：3mL4%甲酸-甲醇溶液，分次洗脫高香草酸,每次1mL吸附劑：乙二胺修飾的超高交聯(lián)樹脂微粒（HXLPP–WAX）無明顯的HVA峰,且尿酸等干擾物質(zhì)的含量很高,不利于分析可去除大量基質(zhì)干擾,選擇性吸附和富集HVA,檢測靈敏度和選擇性提高

高香草酸標樣未經(jīng)固相萃取的尿液萃取富集后的尿液例2、HPLCmethodfordeterminationofverapamilinhumanplasmaaftersolid-phaseextractionVerapamil（維拉帕米，鈣通道阻滯劑）

本實驗在樣品前處理過程中，配制不同溶劑不同pH的樣品溶液，并對TSC(Merck),LiChrolutRP-18(Merck),ENVI-CARB(Supelco)及OasisHLB(Waters)]四種萃取柱的分離效果進行比較。a.SamplespreparedonTSCwith:1-H3BO3and2-KH2PO4

(pH9).b.SamplespreparedonENVI-Carbwith0.01mol/LKH2PO4:1-pH6and2-pH3.c.SamplespreparedonRP-18withKH2PO4

(pH9).d.Samplespreparedon

HLBwith:1-H3PO4and2-KH2PO4

(pH9)D:地爾硫卓（內(nèi)標）V:維拉帕米基質(zhì)干擾小；分離度達到要求雜質(zhì)干擾；拖尾未檢出，分析物流失干擾物質(zhì)一起吸附解吸附固相萃取條件吸附劑：HLB小柱，N－乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物淋洗液：

1mL65%甲醇-2%NH4OH洗脫劑：1mL65%甲醇-2%乙酸樣品溶液：1ml血樣（含50μLHPLC內(nèi)標，diltiazem，地爾硫卓）溶于1ml0.1mol/LKH2PO4溶液（pH9）綴合物的水解綴合物：藥物或其代謝物與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)

結(jié)合生成的產(chǎn)物。內(nèi)源性物質(zhì)：葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等。尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài)。綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取，為測定尿藥總量,需水解綴合物。方法：

0.1NHCl，100℃，30min

簡便,快速水解過程中發(fā)生藥物分解專一性較差條件：pH4.5~5.5,37℃葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶專屬性強時間較長可引入粘蛋白

溶劑萃取過程中綴合物(尤其硫酸酯)直接分解條件溫和常用酸水解或酶水解1.酸水解法2.酶水解法3.溶劑解法目前對于綴合物的分析，逐漸趨向于直接測定綴合物的含量（HPLC和RIA法），以提供更多藥物代謝信息。酶水解：

尿樣1ml加入pH4.8緩沖液50ul加β-葡萄糖醛酸苷酶0.1ml37℃水浴12h代謝物的萃?。杭觾?nèi)標物（艾司唑侖）加pH10.8緩沖液調(diào)節(jié)尿樣pH=9加乙醚5ml，渦旋2min離心萃取取乙醚層，揮干后殘渣加甲醇0.1ml溶解進樣GC血液和尿液中三唑侖的GC測定法化學衍生化在色譜過程中，用特殊的化學試劑借助化學反應(yīng)給樣品化合物接上某個特殊基團，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)衍生物之后進行檢測的方法。包括紫外衍生化法、熒光衍生化法、電化學衍生化法和手性衍生化法。③含-NH2、-COOH、-OH官能團的藥物常使色譜峰拖尾；①使極性藥物變成非極性的、易于揮發(fā)的藥物，使具有能被分離的性質(zhì)；②增加藥物的穩(wěn)定性；④為提高對光學異構(gòu)體的分離能力。GC中衍生化的目的（一）GC中的衍生化GC中的衍生化的主要反應(yīng)-OH、-COOH、–NH-的極性基團藥物常用的硅烷化試劑：三甲基氯硅烷（TMCS）、雙-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）等-OH、–NH2–NH-的極性基團藥物常用的?；噭阂宜狒?、丙酸酐等；

采用不對稱試劑，使其生成非對映異構(gòu)體衍生物常用的不對稱試劑有：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、（S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。硅烷化?；榛菍τ钞悩?gòu)體-OH、–COOH、–NH-的極性基團藥物常用的烷基化試劑：碘庚烷、疊氮甲烷、氫氧化三甲基苯胺（TMAH）等；（一）GC中的衍生化①提高對樣品的檢測靈敏度②改善樣品混合物的分離度③適合于進一步作結(jié)構(gòu)鑒定，如質(zhì)譜、紅外、核磁共振HPLC中衍生化的目的（二）HPLC中的衍生化對衍生化反應(yīng)的要求：①能迅速、定量地進行，且反應(yīng)條件溫和；②選擇性高，最好只與待測成分反應(yīng)，衍生化試劑和副產(chǎn)物不干擾樣品的分離和測定；③衍生化試劑方便易得，通用性好。（二）HPLC中的衍生化柱前衍生化