第10章-液相色譜法

注：自帶護(hù)膚品（高效液相色譜法）離子色譜法1月6日(星期日)補(bǔ)1月3日（星期四）的課程第十章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC一、HPLC概述二、高效液相色譜儀三、高效液相色譜法的類型一、高效液相色譜法概述氣相色譜：流動(dòng)相為氣體液相色譜：流動(dòng)相為液體，70年代以后，在高壓下輸送流動(dòng)相，稱之為高效液相色譜（高壓液相色譜），簡(jiǎn)稱為HPLC。HPLC與GC主要差別：分析對(duì)象差別

GC（20％）：能氣化、熱穩(wěn)定性好且沸點(diǎn)較低的樣品，

HPLC（80％）：溶解后能制成溶液的樣品，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)流動(dòng)相差別

GC：流動(dòng)相為惰性氣體；組分與流動(dòng)相無(wú)作用力，只與固定相作用

HPLC：流動(dòng)相為液體（種類多，另可選用不同比例的多種液體作為流動(dòng)相）；流動(dòng)相與組分間有親合作用力，柱選擇性好、分離效果佳操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓二、高效液相色譜儀高效液相色譜儀簡(jiǎn)單流程圖2.1高壓輸液系統(tǒng)貯液器：貯存流動(dòng)相，由玻璃、不銹鋼或氟塑料作成（0.5~2L）高壓泵：作用：將貯液器中的流動(dòng)相以高壓（150～350×105Pa）形式連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)性能：高壓、恒流、壓力變化小、流量范圍可調(diào)、耐腐蝕、密封性好主要類型：往復(fù)式柱塞泵（恒流）當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時(shí)，流動(dòng)相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動(dòng)相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動(dòng)相就由其儲(chǔ)液器吸入缸體中。（內(nèi)梯度）（外梯度）梯度洗脫置（程序升溫裝置）：概念：在分離過(guò)程中使用兩種或兩種以上的不同極性的溶液為流動(dòng)相，通過(guò)不斷改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH或離子強(qiáng)度相應(yīng)的改變，從而使各組分以它們的最佳k’值通過(guò)色譜柱，達(dá)到高的分離效果。分類：內(nèi)梯度和外梯度

LC梯度洗脫與GC程序升溫的比較a、弱溶劑時(shí)，k’大的組分未流出；b、強(qiáng)溶劑時(shí)，k’小的組分分不開；c、中等強(qiáng)度溶劑時(shí)，k’小的組分1，2分不開；

d、梯度洗脫，各組分得到良好的分離2.2進(jìn)樣系統(tǒng)作用：把分析試樣有效地送入色譜柱進(jìn)樣方式：微量注射器；進(jìn)樣閥（耐高壓的六通閥：自動(dòng)化進(jìn)樣、重現(xiàn)性好）2.3分離系統(tǒng)（色譜柱）作用：實(shí)現(xiàn)組分的分離性能：直形（由不銹鋼制成）；內(nèi)徑：2~6mm；長(zhǎng)度：10~50cm2.3檢測(cè)系統(tǒng)作用：檢測(cè)并收集各組分類型：溶質(zhì)型檢測(cè)器和總體檢測(cè)器兩種溶質(zhì)型檢測(cè)器：對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，例：紫外、DAD、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等總體檢測(cè)器：對(duì)試樣和洗脫液總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，例：示差折光、介電常數(shù)檢測(cè)器等紫外檢測(cè)器：應(yīng)用最廣，可用于梯度洗脫，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)

光源：低壓汞燈，254或280nm（固定波長(zhǎng)）；氫燈、氘燈，200-400nm（可調(diào)波長(zhǎng)）

檢測(cè)池：很小，（1mm×10mm，容積小于10μL）；

接收元件：光電倍增管二極管陣列檢測(cè)器（DAD)：可得到所有波長(zhǎng)上的色譜信號(hào)

紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。美國(guó)惠普公司—1100型液相色譜儀三、HPLC的主要類型及分離原理流動(dòng)相要求：流動(dòng)相純度高不使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑能溶解樣品，但不與樣品發(fā)生反應(yīng)粘度小，以此提高柱效與所選用的檢測(cè)器匹配固定相分類：承受壓力：剛性固體（可承受高壓，以二氧化硅為基質(zhì)，表面鍵合各種官能團(tuán)，成化學(xué)鍵合固定相）；硬膠（承受壓力低，由聚苯乙烯和二乙基苯交連而成）孔隙深度：表面多孔型和全多孔型液固色譜（LSC,liquid-solidadsorptionchromatography）固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；

應(yīng)用：用于分離相對(duì)分子量中等的油溶性物質(zhì)，另用于分離不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體。缺點(diǎn)：非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)象（2）應(yīng)用和缺點(diǎn)脲的取代物與氨基甲酸酯的高速分離硝基苯胺異構(gòu)體在10

m氧化鋁上的LSC分離液液分配色譜（LLPC)固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。固定相：將固定液化學(xué)鍵合于載體（硅膠）表面形成固定相固定相類型：

極性固定相：正相色譜以極性有機(jī)基團(tuán)如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的

非極性固定相：反相色譜反相色譜法最常用的固定相是C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）和苯基鍵合相的填料。化學(xué)鍵合相色譜（CBPC)固定相使用條件：

為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值，但需要注意的是，C18使用的pH值通常為2.5~7.5。太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對(duì)非極性流動(dòng)相

正已烷、環(huán)已烷

3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強(qiáng)化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡(jiǎn)稱ODS）、C82.極性流動(dòng)相

水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出

IC是HPLC的一種，是分析水溶液中陰離子的最佳方法。固定相是離子交換樹脂，流動(dòng)相是淋洗液(強(qiáng)電解質(zhì))；電導(dǎo)檢測(cè)器。常用的淋洗劑是Na2CO3-NaHCO3混合液。只要改變兩種物質(zhì)的濃度比，就可以得到不同淋洗能力和pH值的流動(dòng)相。為消除淋洗液中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制柱或抑制器。離子色譜法（IC）ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－臨時(shí)過(guò)程ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋（1）原理：離子交換（離子價(jià)態(tài)和離子半徑）淋洗液瓶Pump保護(hù)柱分析柱抑制器裝置電導(dǎo)池色譜工作站淋洗液輸送離子交換分離抑制電導(dǎo)檢測(cè)數(shù)據(jù)采集和儀器控制樣品注射（2）離子色譜結(jié)構(gòu)電導(dǎo)檢測(cè)器：檢測(cè)具有電導(dǎo)性化合物的通用型檢測(cè)器，最常用。溶液至檢測(cè)池電極檢測(cè)池抑制器：安裝在電導(dǎo)池之前提高待測(cè)離子的電導(dǎo)率：提高靈敏度Na+,Cl-H+,Cl-

降低背景電導(dǎo)(淋洗液)：

減少噪音Na+,HCO3-H2CO3Na+,OH-H2O極限摩爾電導(dǎo)值

陽(yáng)離子

＋－陰離子

Ｈ＋Ｌｉ＋Ｎａ＋Ｋ＋ＮＨ４＋Ｍｇ２＋Ｃａ２＋ＯＨ－Ｆ－Ｃｌ－Ｂｒ－ＮＯ３－ＰＯ４３－ＳＯ４２－198

55

46

78

71

80

80（單位：μS/m

當(dāng)量）350395074735360抑制器的作用背景：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～保留時(shí)間電導(dǎo)NaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4背景：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～保留時(shí)間電導(dǎo)HFHClHNO3H3PO4H2SO4保留時(shí)間背景：H2CO3(15μS)電導(dǎo)免試劑離子色譜（Reagent-Free?）：傳統(tǒng)離子色譜的問(wèn)題——手工配制淋洗液和再生液（3）離子色譜的最新發(fā)展離子色譜樣品前處理常規(guī)樣品離子分析痕量離子分析大體積進(jìn)樣

在線濃縮復(fù)雜基體中離子的處理預(yù)處理小柱SPE小柱過(guò)濾：樣品中有顆粒狀物質(zhì)基體消除：*去除樣品中所包含的，有可能損壞儀器或者影響色譜柱/抑制器性能的成分——重金屬離子、有機(jī)大分子*去除樣品中所包含的，有可能干擾目標(biāo)離子測(cè)定的成分——高離子強(qiáng)度基體0.22，0.45um濾膜——去除顆粒狀雜質(zhì)C18預(yù)處理小柱、On-GuardRP\P柱——去除有機(jī)分子On-GuardH柱——去除溶液中的金屬離子On-GuardAg柱——去除溶液中的Cl-離子主要測(cè)定高氯物質(zhì)中的NO2-，NO3-等離子On-GuardBa柱——去除溶液中的硫酸根水中陰陽(yáng)離子測(cè)定的樣品前處理1.純凈水中陰離子測(cè)定--------直接進(jìn)樣2.自來(lái)水\地下水中陰離子的測(cè)定--------0.45um濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析3.地表水\生活污水中陰離子測(cè)定---------離心過(guò)濾后,用C18與0.45um濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析4.工業(yè)廢水----------離心過(guò)濾后,用On-GuardH柱與0.45濾膜過(guò)濾進(jìn)樣（4）應(yīng)用：在IonPacAS9-HC上分離消毒副產(chǎn)物色譜柱：IonPacAG9-HC,AS9-HC淋洗液：9mmol/LNa2CO3

流速：1mL/min

進(jìn)樣量：25μL色譜峰：1.氟離子

3 mg/L2.亞氯酸根

103.溴酸根

204.氯離子

65.亞硝酸根

156.溴離子

25

7.氯酸根

25

8.硝酸根

25

9.磷酸根

40

10.硫酸根

30

0(22)8(30)0Minutes2015105μS2512345678910水負(fù)峰空間排阻色譜（1）分離原理固定相：凝膠，含有許多不同尺寸的