海洋生物體中金剛烷胺的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

1海洋生物體中金剛烷胺的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法警告：實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液、有機(jī)溶劑等均具有一定的毒性和揮發(fā)性，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)避免與其直接接觸，樣品前處理過程應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。本文件描述了海洋生物體中金剛烷胺液的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，包括原理、試劑及配制、儀器和設(shè)備、樣品、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、準(zhǔn)確度、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證、廢物處置等。本文件適用于海洋生物體魚、蝦、海參、海帶和貝類中金剛烷胺的測(cè)定。當(dāng)稱樣量為3.00g時(shí)，金剛烷胺檢出限為0.5μg/kg，測(cè)定下限為1.0μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理海洋生物體樣品用1%乙酸乙腈提取后，經(jīng)固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑及配制5.1實(shí)驗(yàn)室用水：GB/T6682，一級(jí)。5.2甲醇（CH3OH）：色譜純。5.3甲酸（HCOOH）：色譜純。5.4乙腈（CH3CN）：色譜純。5.5氨水（NH4OH）：優(yōu)級(jí)純。5.6乙酸（CH3COOH）：優(yōu)級(jí)純。5.71%乙酸乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)）。取1mL乙酸，用乙腈定容至100mL。5.85%氨水甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）。取5mL氨水，用甲醇定容至100mL。25.90.1%甲酸溶液（體積分?jǐn)?shù)）。取0.10mL甲酸，用水定容至100mL。5.100.1%甲酸乙腈定容液（體積分?jǐn)?shù)）。將1mL甲酸與300mL乙腈，加入到700mL水中。5.11金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS號(hào)768-94-5，純度大于99.0%。5.12D15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)溶液：CAS號(hào)33830-10-3，1mg/mL。5.13金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液。稱取金剛烷胺0.0100g，用乙腈溶解，并定容至10mL，配制成1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20℃下避光保存，有效期為90d。5.14金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。移取100μL金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5.13），用乙腈溶解，并定容至100mL，配制成1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下避光保存，有效期為30d。5.15D15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液。移取100μLD15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)溶液（5.12），用乙腈溶解，并定容至100mL，配制成1.0μg/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液，4℃下避光保存，有效期為30d。5.16D15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。移取1mLD15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液（5.15），用乙腈定容至10mL，配制成100μg/L內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下避光保存，有效期為7d。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧電離源（ESI源）。6.2天平：感量分別為0.01g和0.0001g。6.3均質(zhì)機(jī)。6.4高速離心機(jī)：10000r/min。6.5超聲波清洗器。6.6渦旋混合器。6.7固相萃取裝置。6.8固相萃取柱：MCX（混合型陽離子固相萃取柱），60mg/3mL，或相當(dāng)者。6.9氮吹儀。6.10聚丙烯離心管：50mL。6.11濾膜：聚偏氟乙烯濾膜，孔徑為0.22μm。7樣品7.1制備魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉，將鱗、皮單獨(dú)收集；蝦，去頭、去殼、去腸腺，取肌肉部分；海參、海帶、貝等取可食部分，樣品充分?jǐn)囁椤⒒靹?。如不能及時(shí)檢測(cè)，-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆?。取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)。7.2提取3稱取3.00(±0.01）g樣品至50mL離心管中，加入100μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.16）和15mL1%乙酸乙腈溶液（5.7），渦旋30s，超聲提取15min，8000r/min離心10min，待凈化。7.3凈化MCX固相萃取柱經(jīng)6mL甲醇（5.2）和6mL水（5.1）活化后，取5mL上清液移入固相萃取柱，3mL水（5.1）淋洗，6mL5%氨水甲醇溶液（5.8）洗脫，全程控制流速為2mL/min～3mL/min。收集洗脫液，用氮吹儀于40℃下吹至近干，用定容液（5.10）定容至1mL，過濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。7.4空白試樣的制備除不加試料外，均按上述測(cè)定步驟進(jìn)行。8分析步驟8.1液相色譜質(zhì)譜條件8.1.1液相色譜條件：a)色譜柱：C18(100mm×2.1mm，1.8μm)，或相當(dāng)者；b)色譜柱溫度：40℃;c)流速：0.25mL/min；d)進(jìn)樣量：10μL；e)流動(dòng)相：A為乙腈（5.4）；B為0.1%甲酸溶液（5.9）；流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。表1流動(dòng)相梯度洗脫程序表mL/min%%5555558.1.2質(zhì)譜條件：a)離子化模式：ESI+；b)電離電壓：2.50kV；c)錐孔電壓：25V；d)離子源溫度：140℃;e)錐孔反吹氣流速：50L/h；f)脫溶劑氣溫度：400℃;g)脫溶劑氣流速：700L/h；h)氬氣流速：0.12mL/min；i)測(cè)定方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM），定量離子和定性離子參數(shù)見表2。4表2待測(cè)物定量離子和定性離子參數(shù)Vaa8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立移取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.14）10μL、20μL、40μL、50μL、100μL于進(jìn)樣瓶中，分別加入100μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.16用定容液（5.10）定容至1mL，使金剛烷胺濃度分別為10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。以各標(biāo)準(zhǔn)工作液金剛烷胺峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8.3試樣測(cè)定按照儀器條件（8.1），分別測(cè)定金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（8.2）、試樣（7.3）、空白試樣（7.4），金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖參見附錄A。9結(jié)果計(jì)算與表示9.1定性分析在同樣測(cè)試條件下，陽性樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測(cè)物的保留時(shí)間偏差在±2.5%以內(nèi)，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的特征離子均應(yīng)出現(xiàn)，且檢測(cè)到的離子的相對(duì)豐度，應(yīng)與濃度相當(dāng)?shù)男Ｕ龢?biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)豐度一致。定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的允許偏差應(yīng)符合表3的要求。表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的允許偏差%%>50>20～50>10～209.2定量分析按8.1設(shè)定儀器條件，待儀器穩(wěn)定后，根據(jù)表2中的定量離子分別對(duì)金剛烷胺和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，記錄保留時(shí)間和峰面積，以峰面積比按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)定量，標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。9.3結(jié)果計(jì)算樣品中金剛烷胺的含量按公式（1）計(jì)算：x= m5式中：x——樣品中金剛烷胺的含量，單位為微克每千克(μg/kgc——試樣溶液中金剛烷胺的濃度，單位為微克每升(μg/L）；c0——空白試樣溶液中金剛烷胺的濃度，單位為微克每升(μg/L）；V——試樣溶液的定容體積，單位為毫升（mL）；m——樣品的濕重，單位為克（g）。9.4結(jié)果表示計(jì)算結(jié)果扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用兩次平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。10準(zhǔn)確度10.1精密度本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。詳見表B.1。10.2正確度金剛烷胺在添加濃度1.0μg/kg～100μg/kg時(shí)，回收率為70%～120%。詳見表B.2。11質(zhì)量控制和質(zhì)量保證11.1空白試驗(yàn)每20個(gè)樣品或每批次（少于20個(gè)樣品/批）應(yīng)至少分析1個(gè)空白試驗(yàn)，空白中金剛烷胺的濃度應(yīng)低于方法檢出限。11.2校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立應(yīng)與批樣測(cè)定同時(shí)進(jìn)行；每20個(gè)樣品或每批次（少于20個(gè)樣品/批）應(yīng)至少分析1個(gè)中間點(diǎn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定值與該點(diǎn)初始濃度的相對(duì)誤差應(yīng)≤30%；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r一般應(yīng)大于0.99。11.3平行樣每20個(gè)樣品或每批次（少于20個(gè)樣品/批）應(yīng)至少測(cè)定一個(gè)平行樣。平行樣測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差應(yīng)在±10以內(nèi)。11.4基體加標(biāo)每20個(gè)樣品或每批次（少于20個(gè)樣品/批）應(yīng)至少測(cè)定一個(gè)基體加標(biāo)樣品，金剛烷胺回收率應(yīng)在70%~120%之間，見附錄B。12廢物處置實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢液和廢物應(yīng)分類收集，集中保管，委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處理。（資料性）色譜圖圖A.1、圖A.2、圖A.3給出了金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、空白樣品色譜圖和加標(biāo)樣品色譜圖。 圖A.1金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（10.0μg/L） 圖A.2空白樣品色譜圖