備課素材知識點：細胞培養(yǎng)的常見污染類型 高中生物人教版選擇性必修3

細胞培養(yǎng)的常見污染類型由于缺乏機體免疫系統(tǒng)等的保護，體外培養(yǎng)的細胞沒有對微生物的防御能力。在體外培養(yǎng)環(huán)境中，有些微生物在攝取營養(yǎng)物質(zhì)方面有競爭優(yōu)勢，并在短時間內(nèi)排出大量代謝產(chǎn)物；有些微生物則附著在細胞表面或進入細胞內(nèi)部。因此，微生物污染會對體外培養(yǎng)細胞的正常生存、生長及功能活動造成極大干擾，嚴重的可致細胞死亡。同時，實驗結(jié)果的準確性和可靠性也大打折扣。所以，保持細胞生存環(huán)境無微生物污染是體外實驗的前提條件。良好的無菌操作可大大降低細胞培養(yǎng)中的微生物污染風(fēng)險。微生物對細胞的影響因污染物和細胞種類的不同而表現(xiàn)各異，一般當污染物持續(xù)存在時，輕者細胞增殖生長緩慢，分裂相減少，細胞變粗糙，輪廓折光增強；重者細胞停止增殖，細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓或從瓶壁脫落。若發(fā)生微生物污染，一般應(yīng)及時將被污染的培養(yǎng)物及相關(guān)試劑在滅菌后按正規(guī)程序丟棄，與被污染培養(yǎng)物接觸過的器材也應(yīng)及時消毒滅菌，防止污染的再次發(fā)生。微生物污染的消除非常困難，且應(yīng)保持隔離并嚴密監(jiān)控，因此不要輕易嘗試消除污染，除非細胞至關(guān)重要且不可替代。由此可見微生物污染的預(yù)防十分重要。為此，首先介紹如何判斷常見的污染。常見污染細胞的微生物有細菌、真菌、支原體、病毒等，不同污染物對細胞的影響有區(qū)別，真菌和細菌繁殖迅速，能在很短時間內(nèi)（如48h）壓制細胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)，而支原體和病毒對細胞形態(tài)和機能的影響是長期的、緩慢的和潛在的。細菌、真菌的污染可通過肉眼和常規(guī)顯微鏡觀察到，支原體、病毒污染的確定則一般需借助其他檢測方法。㈠細菌污染細菌是一類細胞細而短（細胞直徑約0.5μm，長度約0.5~5μm）、結(jié)構(gòu)簡單、細胞壁堅韌、以二等分類方式繁殖和水生性較強的原核微生物。細菌增殖速度很快，能短時間在培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生大量細菌，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁（有時靜置的培養(yǎng)基初看不渾濁，但稍加振蕩，就有很多渾濁物漂起；有時在培養(yǎng)基表面會出現(xiàn)輕微的薄膜或泡沫，或在培養(yǎng)物生長表面出現(xiàn)點狀物，移動培養(yǎng)器皿時則消散）并變?yōu)辄S色（細菌污染后大多能改變培養(yǎng)基pH）。用倒置相差顯微鏡觀察，視野內(nèi)可見點狀的細菌顆粒，并可能出現(xiàn)由細菌遷移引起的閃動，一些細菌會成團或結(jié)合培養(yǎng)的細胞。在細菌污染初期，若使用了抗生素，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置相差顯微鏡也不易觀察、判斷，此時若懷疑有細菌污染，可用無抗生素的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)觀察。若未使用抗生素，培養(yǎng)液改變不明顯，但又疑有污染，可取一份培養(yǎng)基樣本接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)檢測。需注意細菌污染有時可能會和培養(yǎng)基組分的沉淀或細胞碎片混淆，但細菌形態(tài)一致，而沉淀或碎片則形態(tài)不同，并且通常大小不一；細菌團可能與沉淀的蛋白質(zhì)混淆，但細菌團內(nèi)可見很多單個或成串的細菌（特別是晃動后），蛋白質(zhì)沉淀則不然。細菌數(shù)量較多時會使原先清晰的培養(yǎng)背景變得模糊，甚至覆蓋培養(yǎng)物，對培養(yǎng)物的生存構(gòu)成直接的威脅。迅速增殖的細菌，會消耗營養(yǎng)液和產(chǎn)生毒素從而抑制細胞生長，毒性大的細菌會很快導(dǎo)致細胞崩解死亡。㈡支原體污染支原體是介于細菌和病毒之間能獨立生活的最小微生物，無細胞壁，形態(tài)多變，大小介于0.2~2μm之間，多吸附在細胞表面或散在于細胞之間。不同支原體的生物學(xué)性狀有很大差別，一般對熱敏感，對青霉素普遍有抗藥性。由于支原體無致死細胞毒性且可與細胞長期共存，故培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，無明顯變化，或有微細變化卻由于傳代和換液而被緩解。除了細胞培養(yǎng)狀況不佳，采用常規(guī)顯微鏡并不容易觀察支原體污染，其檢出需借助熒光染色、PCR、ELISA、免疫染色、放射自顯影術(shù)、微生物學(xué)分析等方法，其中采用核酸熒光染料進行DNA染色是最簡單和最可信的方法之一。當進行熒光染色時，在40×或100×物鏡下支原體可被顯示為細胞質(zhì)上明確的微?；蚪z狀染色，一般大小、性質(zhì)一致，此時同樣被亮染的培養(yǎng)細胞的細胞核可作為陽性對照。確定是否存在支原體污染需盡可能多地觀察染色樣本，因為不是所有培養(yǎng)的細胞都會被污染。用熒光染色法進行支原體檢測時，培養(yǎng)物的細胞碎片可能會造成假陽性結(jié)果，但細胞碎片不會出現(xiàn)清晰的點狀或絲狀支原體形態(tài)。若仍不能確認，可吸取適量待檢培養(yǎng)基與指示細胞（為已明確無支原體污染且是支原體的適宜宿主，同時生長良好，有足夠的細胞質(zhì)以顯示粘附的支原體，如MDCK細胞）共培養(yǎng)，然后熒光染色來觀察指示細胞表面是否有支原體，從而避免誤判。運用熒光染色法有時會觀察到細胞質(zhì)存在均勻亮染，這可能是由RNA引起的，這類熒光會逐漸變暗，可將染色樣本干燥避光保存后在第2天觀察。如果對熒光檢測的結(jié)果存在懷疑，可重復(fù)檢測或采用其他方法再次檢測。支原體可黏附在宿主細胞表面，從細胞膜獲取脂質(zhì)和膽固醇，造成細胞膜損傷。支原體能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞抗原性，導(dǎo)致染色體畸變，干擾病毒復(fù)制以及具有類似病毒的作用。不同細胞對支原體的感受性和反應(yīng)存在差異。急性支原體污染可能會引起培養(yǎng)細胞狀況的全面惡化，但很多支原體生長緩慢且不破壞宿主細胞（特別是連續(xù)培養(yǎng)的細胞株），它們可通過很多不同的途徑改變培養(yǎng)物的行為和代謝。若細胞被支原體長期污染，會出現(xiàn)增殖減慢、飽和密度下降等，污染嚴重的情況下細胞會從培養(yǎng)器皿脫落，另外懸浮培養(yǎng)的細胞還會出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。㈢真菌污染真菌是一類低等的真核生物，無法進行光合作用，以孢子進行繁殖，一般有發(fā)達的菌絲體，異養(yǎng)吸收型，陸生性較強。真菌種類繁多，形態(tài)各異，若發(fā)生真菌污染，大多肉眼可見白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)基表面，短期內(nèi)培養(yǎng)基多不渾濁，某些真菌污染會導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH升高；顯微鏡下觀察，可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫于細胞之間，懸浮在培養(yǎng)液之中，有時還會產(chǎn)生孢子團，酵母菌和念珠菌則表現(xiàn)為獨立的卵圓形顆粒，并可能出芽。真菌生長迅速，能在短時間內(nèi)抑制細胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細胞，且會在培養(yǎng)板孔間蔓延而很快波及鄰孔。㈣病毒污染病毒為一種大小以納米計、不能獨立地利用外界營養(yǎng)物質(zhì)進行自體繁殖的微生物。病毒種類復(fù)雜，相應(yīng)宿主細胞有特異性，而感染了病毒的宿主細胞形態(tài)學(xué)上不一定有顯著的特異性改變，因此僅靠目測或顯微鏡觀察不能達到檢測目的。應(yīng)根據(jù)不同的病毒選用不同的方法來檢測，常規(guī)有紅細胞吸附試驗、動物接種檢查、電子顯微鏡檢查、免疫學(xué)檢測和PCR等，因?qū)俨《緦W(xué)的研究范疇，普通實驗室不易推廣。病毒進入細胞后，可改變培養(yǎng)物的生物學(xué)性狀，影響培養(yǎng)細胞的生長或干擾實驗結(jié)果的客觀性。為杜絕上述污染，可從以下幾個方面做好預(yù)防工作：（1）培養(yǎng)環(huán)境：1）無菌室：保持清潔，經(jīng)常擦洗，使污染物不易積聚。2）超凈臺：①定期維護和保養(yǎng)，按廠家規(guī)定定期清洗和更換空氣濾器，經(jīng)常保持清潔并用75%乙醇消毒；②操作前提前30min啟動超凈臺紫外燈消毒；③存放的物品應(yīng)全面消毒，并盡可能只將立即使用的物品放入；④細胞培養(yǎng)操作時應(yīng)盡量保持層流，避免氣霧狀污染物進入培養(yǎng)器皿；⑤操作中濺出的液體應(yīng)及時擦去，并用75%乙醇擦拭消毒；⑥實驗完畢后，移走所有物品，并徹底用75%乙醇擦洗工作臺。3）二氧化碳培養(yǎng)箱：①由于箱內(nèi)潮濕，溫度適宜，有利于微生物生長，故應(yīng)定期對培養(yǎng)箱進行清潔和消毒處理。將隔板、水盤和可拆卸部分取出，按去污劑擦洗、清水沖洗、消毒劑擦洗、紫外線照射30min的順序處理，然后放回箱內(nèi)；②水盤內(nèi)使用滅菌蒸餾水或添加真菌抑制劑如硫酸銅（會腐蝕不銹鋼等材質(zhì)的水盤）或?qū)Ｓ脺缇?，并注意及時更換新鮮水；③盡量減少開門次數(shù)，降低污染機會；④若取存細胞時不慎將培養(yǎng)液漏出，經(jīng)及時用75%乙醇擦拭消毒。（2）物品的消毒滅菌：①操作前應(yīng)做好所用器皿、試劑的消毒滅菌工作；②高壓蒸汽滅菌是最常用的方法，不能采用此法滅菌的器皿、試劑，應(yīng)采用其他消毒滅菌方法，如培養(yǎng)基等試劑可過濾除菌，蓋玻片等器械可用75%乙醇浸泡消毒后置于無菌環(huán)境中晾干；③若物品消毒滅菌后長時間未使用，應(yīng)重新處理。（3）個人衛(wèi)生：操作前洗凈雙手，操作時穿清潔的長外衣，同時佩戴無菌的手套、口罩和帽子，手套經(jīng)常用75%乙醇擦拭消毒。（4）無菌操作：防止污染的關(guān)鍵在于嚴格無菌操作。無菌意識不強、動作不準確、操作不熟練等都會造成污染。注意事項主要如下：①細胞培養(yǎng)的操作一定要在超凈臺等層流裝置內(nèi)進行，無菌的試劑、器械一定要在無菌區(qū)開封；②操作時減少交談、咳嗽等防止來自唾沫和呼出氣流造成的污染；③培養(yǎng)試劑不宜過早開瓶，操作時應(yīng)盡可能保持瓶體傾斜，所有瓶口不能與超凈臺的風(fēng)向相逆，使用后應(yīng)立即封閉瓶口；④培養(yǎng)的細胞處理前也不要過早暴露于空氣中；⑤不要在打開器皿上方操作；⑥不允許用手觸及器皿的無菌部分（如瓶口、瓶蓋內(nèi)側(cè)）；⑦吸取液體時應(yīng)專管專用，及時替換；⑧若無菌器物的尖端接觸到非無菌物品表面，應(yīng)及時更換；⑨為確保培養(yǎng)物的安全，應(yīng)盡早凍存有價值的培養(yǎng)物；⑩對新引進的細胞株、血清等生物材料應(yīng)先隔離培養(yǎng)觀察，防止外來的污染源。（5）抗生素：沒有哪種抗生素都能