ligation independent cloning-分子克隆技術(shù)課件

Ligation-independentcloning2011.12.19ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)經(jīng)典的克隆方法經(jīng)典的克隆方法，主要分為以下兩種：(1)粘性末端連接，即載體質(zhì)粒和待插入的外源片段都通過(guò)合適的限制性?xún)?nèi)切酶切割，產(chǎn)生相互匹配的粘性末端，然后在連接酶作用下重新形成磷酸二酯鍵而得到環(huán)化的重組質(zhì)粒；(2)平末端連接，平末端連接中，載體和片段均為平端，都沒(méi)有粘性末端突出。優(yōu)點(diǎn)：依賴(lài)連接酶的克隆方法簡(jiǎn)單高效，是克隆單個(gè)基因的常用的方法。不足：一方面，插入片段要經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶處理，這樣在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就要考慮目的基因的DNA序列，不能實(shí)現(xiàn)多基因的平行操作，不適合高通量；另一方面，該過(guò)程使用連接酶，不但延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)的周期，而且也會(huì)帶來(lái)載體自連背景，增加了篩選工作量。PCR雙酶切雙酶切連接ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)ligation-independentcloning在很多情況下，重組DNA技術(shù)的應(yīng)用都會(huì)受到基因序列中原有的酶切位點(diǎn)的限制，尤其是多基因片段的重組往往更容易受到限制酶酶切位點(diǎn)序列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶切位點(diǎn)或者采用其它的DNA重組方法，大大增加了DNA重組的工作量和難度。因此，開(kāi)發(fā)一種不受序列限制而且需要準(zhǔn)確重組的新方法就顯得十分重要。Aslanidis和deJong(1990)在1990年所提出的不依賴(lài)連接反應(yīng)克隆(ligation-independentcloning,LIC)充分滿(mǎn)足了上述要求。這種方式不僅克服了常規(guī)依賴(lài)連接酶克隆方法的缺點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)便、方法快捷及連接效率高，應(yīng)用日益廣泛。在T4DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一種特定的dNTP存在的緩沖液條件下反應(yīng)，插入片段能產(chǎn)生10~15個(gè)堿基的粘性末端(AslanidisanddeJong,1990)。載體和PCR片段依靠長(zhǎng)的粘性末端重組，此過(guò)程不需要連接酶。這種克隆方法不需要考慮插入片段的序列，任何基因都能被克隆到該載體中。而且，整個(gè)流程簡(jiǎn)單到不需要任何限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶，兩者在體外條件下孵化，互補(bǔ)的粘性末端退火形成環(huán)狀分子，經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞后，細(xì)菌的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)這些突出和缺口而得到正確重組子(如圖)。劉超等,2011,不依賴(lài)于連接反應(yīng)克隆(LIC)的技術(shù)進(jìn)展,基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),Vol.30No.13(DOI:10.5376/.2011.30.0013)ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)LIC方法的特點(diǎn)LIC方法依賴(lài)于T4DNA

Polymerase的核酸外切酶活性，這樣就要求被處理的線(xiàn)性載體和片段的末端僅含有3種堿基，這樣才可以有效控制反應(yīng)以產(chǎn)生特定大小的粘性末端。要求載體有較固定的粘性末端，且對(duì)于如何使載體線(xiàn)性化有特殊的要求。LIC方法的優(yōu)勢(shì)在于：(1)待克隆的PCR片段不需要限制性?xún)?nèi)切酶處理。這樣就省去了在設(shè)計(jì)引物時(shí)考慮各種酶切位點(diǎn)的麻煩，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以實(shí)行并行操作，對(duì)所有的樣品進(jìn)行同樣的處理。(2)速度快。T4

DNAPolymerase所需的時(shí)間只要40min，然后75℃熱處理20min，載體與目的片段共混孵育10min。相比經(jīng)典的克隆方法更節(jié)約時(shí)間。(3)克隆效率高且操作簡(jiǎn)便。如前所述，該方法不依賴(lài)連接酶，完全是靠粘性末端配對(duì)退火，所以不匹配的末端不可能形成雙鏈，載體自連背景低。(4)相對(duì)而言費(fèi)用較低。該方法中所需要的引物雖然有額外10~15bp附加堿基，但是相對(duì)而言位點(diǎn)特異性重組中所要求的引物是較短的，而且克隆過(guò)程中省去了連接酶，也沒(méi)有使用價(jià)格不菲的特殊重組酶。綜合以上幾個(gè)方面考慮，LIC是一種適合于高通量基因克隆和蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)秀方法。ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)LIC方法的改進(jìn)——SLIC在很多情況下，DNA片段的克隆和表達(dá)，尤其是多基因片段的重組往往會(huì)受到限制酶酶切位點(diǎn)序列的限制，因此，建立一種不受序列限制而且需要準(zhǔn)確重組的新方法就顯得十分重要．Li&Elledge所建立的不依賴(lài)序列和連接的克隆方法(sequenceandligation-independentcloning，SLIC)就能滿(mǎn)足上述要求．該方法不受DNA序列的限制，可以將任意序列的多個(gè)DNA片段組裝到一起，而且不需要連接反應(yīng)即可完成體外的重組．該方法的基本原理如下：利用PCR技術(shù)在插入片段的兩側(cè)分別加上幾十bp的同源末端，參加重組的片段分別在沒(méi)有dNTP存在的情況下用T4DNA聚合酶中的3’-5’外切酶活性22℃處理，產(chǎn)生含有同源序列的5端突起．突出端的長(zhǎng)度可以通過(guò)控制3’-5’外切酶活性的作用時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)，加入dCTP即可終止外切酶活性．將各片段的酶切產(chǎn)物按等摩爾比混合，在T4DNA連接緩沖液中于37℃完成突出單鏈的復(fù)性重組，形成含有大的缺口的環(huán)狀中間體．用此中間體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用大腸桿菌本身的修復(fù)機(jī)制完成中間體的修復(fù)．SLIC用途廣泛，它不僅可用于任何2個(gè)DNA片段的重組，而且可用于多個(gè)DNA片段的重組．劉超等,2011,不依賴(lài)于連接反應(yīng)克隆(LIC)的技術(shù)進(jìn)展,基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),Vol.30No.13(DOI:10.5376/.2011.30.0013)ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)ligation-independentVectorsVectorTagExpressionHostResistanceTag(s)Size2BTHis6-tev-yORFE.coliT7AMP2kDa2CTHis6-MBP-N10-tev-yORFE.coliT7AMP45kDa2GTHis6-GST-tev-yORFE.coliT7AMP28kDa2NTHis6-NusA-tev-yORFE.coliT7AMP58kDa2STHis6-Sumo-tev-yORFE.coliT7AMP14kDayORF(youropenreadingframe)ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)Solubility-EnhancingTags促溶標(biāo)簽通常是一些可以增強(qiáng)融合蛋白表達(dá)量及溶解性的大分子量的多肽或者蛋白。一些融合標(biāo)簽如GST、MBP因?yàn)橥瑫r(shí)可以用作親和層析的標(biāo)簽，所以經(jīng)常被用在蛋白純化過(guò)程中。而一些其他的融合標(biāo)簽，如NusA,thioredoxin(TRX),smallubiquitin-likemodifier(SUMO),andubiquitin(Ub)則需要添加額外的親和標(biāo)簽來(lái)用于蛋白純化。并不存在某一種融合標(biāo)簽可以解決所有蛋白的表達(dá)及溶解性問(wèn)題。然而，實(shí)踐證明某些融合標(biāo)簽在促進(jìn)溶解性方面比別的蛋白更有優(yōu)勢(shì)。有研究表明這些融合標(biāo)簽在促進(jìn)表達(dá)量方面和溶解性的作用是不同的。TRX>SUMO~NusA>Ub~MBP~GST.（表達(dá)量）SUMO~NusA>Ub~GST~MBP~TRX.（溶解性）因此，SUMO和NusA是相對(duì)比較理想的促進(jìn)表達(dá)量及溶解性的選擇?！緟⒖肌縁usionTagsforProteinExpressionandPurificationligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)NusA標(biāo)簽NusA融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)于1999年由Davis發(fā)明，并在2000年由Novagen首先進(jìn)行商業(yè)化設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)，特別推薦用于以NusA作為N端標(biāo)簽時(shí)提高在大腸桿菌中難溶的重組表達(dá)蛋白的可溶性。已有充分的證據(jù)證明NusA標(biāo)簽系統(tǒng)能顯著提高多種不同來(lái)源蛋白的可溶性表達(dá)，而這些蛋白在單獨(dú)表達(dá)時(shí)往往形成不可溶的包涵體。在一些研究報(bào)告中，用蛋白酶切除NusA標(biāo)簽?zāi)苁鼓康牡鞍兹员３终_折疊和生物學(xué)活性；相反，在另外許多報(bào)道中也指出當(dāng)目的蛋白與NusA融合而非切除時(shí)，融合蛋白也同樣具有活性。NusA標(biāo)簽系統(tǒng)的成功至少部分地是由于其與大腸桿菌分子伴侶系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。NusA標(biāo)簽提高蛋白可溶性的可能機(jī)制：Houry（1999）等揭示NusA蛋白是分子伴侶GroEL在體內(nèi)的必須底物。而GroEL與其共作用因子GroES是大腸桿菌唯一的在所有生長(zhǎng)條件下必需的分子伴侶系統(tǒng)。Douette等（2005）研究了融合蛋白NusA-UCP1（uncouplingprotein1）的可溶產(chǎn)量。UCP1是一種線(xiàn)粒體膜蛋白。這些作者發(fā)現(xiàn)16℃培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)GroEL共過(guò)表達(dá)的情況下，融合蛋白的可溶性有更大的提高。這個(gè)結(jié)果也表明NusA與分子伴侶途徑相作用，從而阻止參與蛋白的聚集。

【參考】NusA技術(shù)：顯著增強(qiáng)大腸桿菌表達(dá)可溶、活性蛋白：ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)>2BTEcoliT7ColE1-oriLICv1transferHis6-tev-yORFAMP（全長(zhǎng)4876bp）TTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAACATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGCCAGGACCCAACGCTGCCCGAGATGCGCCGCGTGCGGCTGCTGGAGATGGCGGACGCGATGGATATGTTCTGCCAAGGGTTGGTTTGCGCATTCACAGTTCTCCGCAAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGCCTACAATCCATGCCAACCCGTTCCATGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATCGCCGTGACGATCAGCGGTCCAGTGATCGAAGTTAGGCTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCTGTCCCTGATGGTCGTCATCTACCTGCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGATGCCGCCGGAAGCGAGAAGAATCATAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCGCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGTGCCGGCTCCGGAGAGCTCTTTAATTAAGCGGCCGCCCTGCAGGACTCGAGTTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATCTTCTCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGAAGTGGATAACGGATCCGCGATCGCGGCGCGCCACCTGGTGGCCGGCCGGTACCACGCGTGCGCGCTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGTGCCGGCTCCGGAGAGCTCTTTAATTAAGCGGCCGCCCTGCAGGACTCGAGTTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATCTTCTCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGAAGTGGATAACGGATCCGCGATCGCGGCGCGCCACCTGGTGGCCGGCCGGTACCACGCGTGCGCGCTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGCATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGGATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAAT7promoterprimerTEV酶切位點(diǎn)：ENLYFQ^SSspI酶切位點(diǎn)：AAT^ATTT7terminatorprimer2BTligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)：先設(shè)計(jì)與目的序列對(duì)應(yīng)的18-21bp的匹配區(qū)(匹配區(qū)域的序列長(zhǎng)度可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整)，再在5’端加上LICtagsequence：PCRT4

DNAPolymerase

+dCTP處理后ligationindependentcloning-分子克隆技術(shù)LICprotocol設(shè)計(jì)PCR引物：正向：5’-TACTTCCAATCCAATGCA+目的匹配序列-3’反向：5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTA+互補(bǔ)配對(duì)序列-3’PCR，并切膠回收目的條帶T4聚合酶處理(20μL)：5μLPurifiedPCR2μLT4buffer0.5μLdCTP(100mM)1μL100mMDTT1μLT4polymerase(1U/μL)10.5μLH2O22℃反應(yīng)40min后，75℃熱處理20min使酶失活。LIC質(zhì)粒抽提(500ng)SspI單酶切，使質(zhì)粒線(xiàn)性化切膠回收線(xiàn)性化的質(zhì)粒T4聚合酶處理(20μL)：10μLLinearizedVector2μLT4buffer0.5μLdGTP(100mM)1μL100mMDTT1μLT4polymerase(1U/μL)5.5μLH2O(在維持質(zhì)粒與酶的比例前提下，酶切體系可以適當(dāng)放大)22℃反應(yīng)40min后，75℃熱處理20min使酶失活。2μLLICedinsert+2μLLICedvector+6μLH2O，室溫下孵育5-30min后，取5μL轉(zhuǎn)化top10.?。。?！ligationindependentcloning-分