動物產(chǎn)品及飼料中黃牛、水牛和牦牛源性成分實時熒光PCR檢測方法

1法GB/T6682分析實驗室用水規(guī)GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-riboPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetePBS：磷酸鹽緩沖液（phosphateb2FAM：6-羧基熒光素（6-carbox）；冰箱（2℃~8℃,-20℃,-80℃);a)上游引物cyt-p1：5’-C(AT)TACACCTTCCTAGAAACATGAAAb)下游引物cyt-p2：5’-TGG(CT)AGTAC(AG)TA(CT)CCTAT(AG)AATGCTGT(AG)-3a)上游引物cox-p1：5’-CTATATTTTAATTTTACCb)下游引物cox-p2：5’-CTATGTATCCGAATTGTTCTT-a)黃牛源性成分檢測探針cattle-p：5’-FAM-TAATCCTTCTGCTCAC-BHQ-3’b)水牛源性成分檢測探針buffalo-p：5’-HEX-TAATCTCCCACATTGTA-BHQ-3’c)牦牛源性成分檢測探針yak-p：5’-CY5-TGGAGTAATTCTTCTACTTAC-BHQ-3’），4c=A×N×50/1000……………（1）c——DNA濃度，單位為微克每微升(μg/μL當(dāng)A9.1反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系總體積為25μL。根據(jù)需檢測的牛源性成分種類，加入相應(yīng)的檢測引物和探針溶液各0.5μL，模板液加入2～5μL，再參照選用的PCR檢測試劑盒說明書加入其它相關(guān)試劑和模板液進行體系的PCRMasterMix試劑盒為例，列出反應(yīng)體系配制表，僅供參考）。同時設(shè)置9.2設(shè)置實驗對照設(shè)置陰性對照時，以其他動物肉品（如：豬肉9.2.2空白對照9.2.3.1同時檢測黃牛、水牛和牦牛三種源性成分9.2.3.2只檢測黃牛、水牛或牦牛其中一種或兩種源性成分時，則采用需檢測的牛肉種類提取DNA，作9.3.1反應(yīng)條件設(shè)定5報告熒光（reportdye）分別按需檢測的牛源性成分探針標(biāo)記物的種類進行設(shè)定，其中黃牛源性檢測選定FAM，水牛源性檢測選定HEX，牦牛源性檢測選定CY5。淬滅熒光（quenchdye）設(shè)定為None?？筛鶕?jù)不同品牌儀器說明等效設(shè)置相關(guān)參數(shù)。當(dāng)出現(xiàn)35.0<Ct值≤38.0時，判為結(jié)果可疑，需重新檢測。對于可疑結(jié)果6+++表明從樣品中同時檢出黃++—表明從樣品中同時檢出黃+—+表明從樣品中同時檢出黃 ++表明從樣品中同時檢出水+ 只有FAM熒光被檢出，Ct值≤35.0且呈現(xiàn)典型擴增曲線，表明從樣品中只檢出黃牛 + 只有HEX熒光被檢出，Ct值≤35.0且呈現(xiàn)典型擴增曲線，表明從樣品中只檢出水牛 +只有CY5熒光被檢出，Ct值≤35.0且呈現(xiàn)典型擴增曲線，表明從樣品中只檢出牦牛 A.11.0mol/L、pH8.0三（羥甲基）氨A.30.5mol/L、pH8.0乙A.6磷酸鹽緩沖溶液（0.01mo89B.1同時檢測黃牛、水牛和牦牛的三重實時熒光P在上述配制好的PCR反應(yīng)液中，按實驗設(shè)置，加入下列相應(yīng)的模板液：在上述配制好的PCR反應(yīng)液中，按實驗設(shè)置，加入下列相應(yīng)的模板液：catacaccttcctagaaacatgaaacattggagtaatccttctgctcacagtaatagccacagcactatattttaattttacccgggttcggta