微生物論文-自來水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定-2

PAGEPAGE3自來水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定摘要眾所周知，人類的生存離不開水，各種自然界存在的水中常含一定數(shù)量的微生物。水中微生物的主要來源是：水中的水生性微生物（如光合藻類）、來自土壤徑流、降雨的外來菌群和來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中細(xì)菌總數(shù)可說明被有機(jī)物污染的程度，細(xì)菌數(shù)越多，有機(jī)物含量越大。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用平板菌落技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)，由于水中細(xì)菌種類繁多，他們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大，所以計(jì)算出來的細(xì)菌總數(shù)僅是近似值。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在保證無菌的環(huán)境下，采取自來水的樣品，利用培養(yǎng)基制作平板［1］。自來水的微生物學(xué)檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。關(guān)鍵字牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基自來水平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)細(xì)菌引言水中微生物含量對(duì)該水源的飲用價(jià)值很大。一般認(rèn)為，作為良好的飲用水其細(xì)菌含量應(yīng)在１００個(gè)／ｍｌ以下，當(dāng)超過５００個(gè)／ｍｌ時(shí)，即不適合作飲用水了。水質(zhì)的好壞對(duì)人們生活起著至關(guān)重要的作用，而判斷水質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，微生物在水中的數(shù)量、種類是必不可少的。自來水的微生物學(xué)檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。目前城市自來水廠出廠的自來水在微生物學(xué)指標(biāo)上都能達(dá)標(biāo),不必?fù)?dān)心會(huì)引起介水傳染病的發(fā)生。但自來水中的微量有機(jī)物看不見、也不會(huì)引起急性疾病,在人體內(nèi)日積月累,產(chǎn)生的遠(yuǎn)期毒副作用卻不容忽視［2］。長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)多采用異養(yǎng)菌平板計(jì)數(shù)法(HeterotrophicPlateCounts，HPC)和最大或然數(shù)法(MostProbableNumber，MPN)來測(cè)定飲用水中的活菌數(shù)．但由于飲用水中的貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境有別于傳統(tǒng)培養(yǎng)基提供的富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，大多數(shù)在顯微鏡下觀察到的細(xì)菌不能在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Nonculturable)，致使活菌計(jì)數(shù)結(jié)果偏低．近些年來，國(guó)外先后應(yīng)用吖啶橙染色直接計(jì)數(shù)(AcridineOrangeDirectCounts，AODC)、活菌直接計(jì)數(shù)(DirectViableCounts，DVC)等方法對(duì)飲用水中的細(xì)菌總數(shù)及活菌數(shù)進(jìn)行快速、直接的鏡檢計(jì)數(shù)．一些新的染色方法，如采用5一氰基一2，3一聯(lián)甲苯四唑鹽酸鹽(5Cyano一2，3一ditolyltetrazoliumchloride，CTC)、核酸探針(BacLight)等對(duì)活細(xì)菌計(jì)數(shù)，都取得了很好地效果．因平板計(jì)數(shù)法相對(duì)簡(jiǎn)單，本實(shí)驗(yàn)即采用本方法，用普通牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在保證無菌的環(huán)境下，采取自來水的樣品，利用培養(yǎng)基制作平板。對(duì)自來水用平板菌落技術(shù)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)從而判斷自來水是否符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，是否受到污染。1材料與方法 1.1.1實(shí)驗(yàn)材料自來水1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑牛肉膏蛋白胨NaCl1mol/LNaOH1mol/LHCl蒸餾水1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器高壓蒸氣滅菌鍋滅菌培養(yǎng)皿三角燒瓶天平量筒玻璃棒滴液管燒杯等1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1滅菌1.3.1.1首先將內(nèi)鍋層取出,再向外鍋內(nèi)加入適量的水,使水面與三角擱架相平為宜。1.3.1.2放回內(nèi)鍋層,并加入用報(bào)紙包好的培養(yǎng)皿、三角燒瓶、吸管。1.3.1.3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，使螺旋松緊一致，勿使漏氣。1.3.1.4用電爐加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力上升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用0.1MPa,121℃,20min滅菌。1.3.1.5滅菌時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”時(shí)打開排氣閥，旋松螺旋，打開蓋子，取出滅菌物品。1.3.2水樣的采取放開水龍頭使水流5min后，用已滅菌的三角燒瓶接取水樣，以待分析。1.3.3制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1.3.3.1稱量按培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確的稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。1.3.3.2溶化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。1.3.3.3調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH，直至pH達(dá)7.6。反之，用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。1.3.4細(xì)菌總數(shù)測(cè)定1.3.4.1滅菌吸管吸取1mL水樣，注入滅菌的培養(yǎng)皿中。共做四個(gè)。1.3.4.2分別傾注溶化并冷卻到45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的量為培養(yǎng)基高度的1/3,并立即在桌上作平面旋搖，使自來水和培養(yǎng)基混勻。1.3.4.3另取一空的滅菌培養(yǎng)皿，傾注肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的量為培養(yǎng)基高度的1/3,作空白對(duì)照。1.3.4.4待培養(yǎng)基凝固后，倒置于37℃溫箱中，培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。四個(gè)平板的平均菌落數(shù)即為1mL自來水的細(xì)菌總數(shù)。2結(jié)果與分析2.1結(jié)果測(cè)得培養(yǎng)皿中細(xì)菌菌落數(shù)如下表：平板序號(hào)1234對(duì)照組菌落數(shù)目（個(gè)）134687216534自來水中細(xì)菌總為（134+68+72+165）/4-34=76個(gè)/mL2.2分析由于實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組的菌落數(shù)為34個(gè)/mL，可見培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程中造成了雜菌污染。處理上表中數(shù)據(jù)知，該自來水中細(xì)菌平均數(shù)為76個(gè)/mL,說明實(shí)驗(yàn)過程中有污染，導(dǎo)致結(jié)果有誤差，但由于小于100個(gè)/ml，所以該自來水為良好引用水。2.3討論在本實(shí)驗(yàn)中的空白對(duì)照培養(yǎng)基上長(zhǎng)了細(xì)菌菌落，說明此培養(yǎng)基被污染了，雜菌來源可能是由于：1）培養(yǎng)皿、三角燒瓶、吸管等儀器滅菌不充分；2）滅菌后在空氣中放置又落入雜菌；3）無菌操作技術(shù)不當(dāng)，培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿后沒有立即加蓋；因此，在制作培養(yǎng)基及培養(yǎng)的過程中要嚴(yán)格殺菌，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟認(rèn)真操作，從而使得結(jié)果更加精確［5］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組可能受到污染，以至結(jié)果存在誤差。本實(shí)驗(yàn)的成敗在于滅菌、無菌操作技術(shù)、培養(yǎng)基的溫度等方面是否操作正確，因此接種過程務(wù)必防止雜菌的侵入。實(shí)驗(yàn)過程中，傾注培養(yǎng)基后，培養(yǎng)皿在桌面上做勻速旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基和自來水樣充分搖勻，若沒有搖勻，在培養(yǎng)基中可見一些菌苔。由于菌種在固體培養(yǎng)基上借助重力作用而形成的，所以觀察到絕大多數(shù)的細(xì)菌著生在培養(yǎng)基表面［7］。所以在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）接水前若沒有用火燒水龍頭，就事先打開水龍頭讓水自由流5分鐘以后再接；（2）滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)迅速、立即倒掉冷凝水，防止其影響實(shí)驗(yàn)；（3）當(dāng)溫度在45℃—50℃時(shí)，開始迅速倒平板，溫度過高會(huì)燙死大腸桿菌，過低會(huì)使培養(yǎng)基凝固；（5）在倒平板時(shí)，右手應(yīng)在實(shí)驗(yàn)臺(tái)桌面上平晃培養(yǎng)皿；（6）培養(yǎng)基不能反復(fù)升降溫，傾入培養(yǎng)皿后應(yīng)立即加蓋，且滅菌后不應(yīng)在空氣中放置，以免雜菌混入；（8）數(shù)菌落時(shí)，只計(jì)數(shù)較大的菌落，太小的可忽略不計(jì)。參考文獻(xiàn)［1］陳聲明劉麗麗.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法北京：人民教育出版社，1982［2］朱建平.我們要喝更健康的水：健康博覽2002年05期［3］毛占生，等徽圬染.源飲用水址理[M]北京：中國(guó)建筑工業(yè)出版牡．1999［4］李根生.干燥培養(yǎng)基恩德制造及