食用菌栽培課件24

食用菌栽培課件24第九章菌種的別離、提純、擴(kuò)大、培養(yǎng)與保第一節(jié)菌種的別離與提純進(jìn)入課文三、菌種的提純?nèi)绻麆e離的菌種已污染，可以使用相應(yīng)的方法除掉。(一)使用抑制培養(yǎng)基(二)排除細(xì)菌或酵母菌污染(三)排除霉菌污染(四)菌絲再提純(五)單根菌絲提純技術(shù)(六)菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)量的測(cè)試使用抑制培養(yǎng)基從腐朽嚴(yán)重的木材塊上別離菌絲時(shí)，新生菌常會(huì)伴隨著各種各樣的細(xì)菌、霉菌出現(xiàn)。在這種情況下，可向培養(yǎng)基中參加選擇性強(qiáng)的抗菌劑，如涕必靈(TBZ)或多菌靈(MBC)?？辜?xì)菌的如培養(yǎng)基參加30mg/L左右的四環(huán)素或氯霉素等，以抑制細(xì)菌的出現(xiàn)。此外，也可以在培養(yǎng)基內(nèi)添加鏈霉素30～40mg/L或金霉素20～30mg/L或高錳酸鉀50mg/L。返回排除細(xì)菌或酵母菌污染

組織別離，基內(nèi)菌絲別離將別離物接種在無(wú)冷凝水、硬度較高的斜面培養(yǎng)基上，再降低培養(yǎng)溫度至15～20℃。利用某些大型真菌在較低的溫度下，菌絲生長(zhǎng)速度比細(xì)菌菌苔蔓延速度快的特點(diǎn)，用尖細(xì)的接種針切割菌絲的前端，轉(zhuǎn)接到新的試管斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)2～3次就能獲得所要的純菌絲。也可以用接種鏟將斜面污染的細(xì)菌菌苔鏟除掉，打破試管，挑取內(nèi)部有基內(nèi)菌絲的瓊脂塊，移入無(wú)冷凝水的培養(yǎng)基上。適合于菌齡較長(zhǎng)、被好氣性細(xì)污染的試管。返回排除霉菌污染別離培養(yǎng)后，假設(shè)發(fā)現(xiàn)有色的霉菌小斑點(diǎn)污染，最好放棄。如由同一材料別離得來(lái)的，每支試管都是如此，那就要重新別離。如果霉菌菌落剛出現(xiàn)孢子，孢子尚未成熟，尚未變色，那么可采用前端菌絲切割法提純。如果霉菌菌落的顏色已加深，那么意味著眾多的孢子已成熟，假設(shè)采用前端菌絲切割法提純意義不大?？蓪?%多菌靈的濕濾紙蓋在霉菌的菌落上，以防止提純時(shí)，試管振動(dòng)使孢子擴(kuò)散。然后，用火焰滅菌過(guò)的接種鏟將別離物表層鏟掉，隨之，用另一接種針鉤取別離物位置下的基內(nèi)菌絲。霉菌的污染還常見于棉塞上，這多是棉塞受潮所致。返回(四)菌絲再提純采用切割法或基內(nèi)菌絲挑取法提純后，一般都能獲得純菌絲，但也偶有提而不純的現(xiàn)象發(fā)生，這就必須對(duì)菌絲再提純。為了判斷提純后菌落的純度，將菌絲塊接入瓊脂培養(yǎng)皿平板培養(yǎng)基內(nèi)，如果純種菌絲，菌落會(huì)逐漸向四周輻射狀散開，外緣整齊，如果菌種不純，混有其它絲狀真菌，菌絲生長(zhǎng)速度不一，菌落外緣便參差不齊，培養(yǎng)皿內(nèi)產(chǎn)生的色素也分布不勻。再提純時(shí)，對(duì)菌落中生長(zhǎng)速度較為一致的局部施行菌絲前端切割，移植至新的培養(yǎng)基。返回單根菌絲提純技術(shù)將疑心混有雜菌的菌絲，用尖細(xì)的接種針切割帶有培養(yǎng)基的菌落前端2～3mm2的薄片，移接入PDA培養(yǎng)基，每支試管可移接數(shù)點(diǎn)，放在所別離的菌種的最隹溫度下培養(yǎng)，隔12小時(shí)后，在陽(yáng)光下觀察各接種塊菌絲生長(zhǎng)的狀態(tài)。選取菌絲顯現(xiàn)出分叉狀，用鋒利的接種針仔細(xì)地將貼在培養(yǎng)基面上的單根菌絲帶培養(yǎng)基切割下來(lái)，移入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，塞上棉塞，再用放大鏡觀察判斷是否為單根菌絲，那么應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)12～24小時(shí)后，再重復(fù)上述過(guò)程。適合于菌絲生長(zhǎng)速度快，密度不高的菌類，如草菇返回菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)量的測(cè)試菌絲生長(zhǎng)速度或生長(zhǎng)量的測(cè)定常用于判斷菌種生長(zhǎng)能力的優(yōu)劣或在不同營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境條件下適應(yīng)能力的上下。將適合測(cè)試菌類的培養(yǎng)基填入25㎜×25㎜試管內(nèi)，取略小于試管口徑的小木棒輕輕插入，豎立，在木棒上方加適當(dāng)?shù)闹亓ΑＴ俪槌瞿景?，洗凈試管口，擦干，塞上棉塞，置入手提式高壓滅菌鍋中，常?guī)方法滅菌。滅菌時(shí)間為1小時(shí)，取出冷卻，即成相接近密度的培養(yǎng)基柱。下一頁(yè)菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)量的測(cè)試在無(wú)菌條件下，接入菌齡長(zhǎng)短一致，接種塊大小盡量一致的菌絲塊。豎放并適溫培養(yǎng)。待菌絲蔓延1cm左右，用記號(hào)筆在試管上沿菌絲前沿畫線。數(shù)日培養(yǎng)后，再劃出終止線，這樣就容易計(jì)算出日生長(zhǎng)速度。每樣品重復(fù)3次。通過(guò)不同樣品間的比較，就能從中棄弱留強(qiáng)。但必須指出，菌絲生長(zhǎng)速度量快的，并非出菇最快。產(chǎn)量與質(zhì)量皆好的菌株，還要進(jìn)一步做試驗(yàn)，確定。第二節(jié)菌種的擴(kuò)大、培養(yǎng)一、菌種的擴(kuò)大經(jīng)別離、提純、出菇試驗(yàn)確定為生產(chǎn)用種后，為了適應(yīng)生產(chǎn)栽培需要，要進(jìn)行菌種的擴(kuò)大、繁殖。二、貼標(biāo)簽無(wú)論是菌種別離、提純，還是一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)種的擴(kuò)大，無(wú)菌操作后應(yīng)馬上貼標(biāo)簽。三.菌種培養(yǎng)培養(yǎng)室內(nèi)溫度、濕度、光照、空氣等條件彼此聯(lián)系，互相影響。(一)一級(jí)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)1.單一菌絲類型一級(jí)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)(1)單一菌絲類型一級(jí)菌種接種無(wú)菌操作要點(diǎn)a在無(wú)菌箱內(nèi)，將待接的斜面試管(無(wú)冷凝水)、購(gòu)來(lái)或自行培養(yǎng)好的一級(jí)原始種，酒精燈、火柴盒、接種針等放入接菌箱內(nèi)。下一頁(yè)單一菌絲類型一級(jí)菌種接種無(wú)菌操作要點(diǎn)b按接種箱操作規(guī)程進(jìn)行消毒。c翻開工作燈，用75%的酒精棉球擦雙手，伸入接種箱內(nèi)，再擦接種工具。d點(diǎn)燃酒精燈。5右手持接種針，將頂端燒紅，并將整支接種針過(guò)火幾次。6用左手手指和手掌托持兩支試管，食指與中指與中指夾持一級(jí)原始種，無(wú)名指和小指夾持空白斜面培養(yǎng)基試管。用右手無(wú)名指和小指夾持原始種棉塞，小指和魚際夾持空白試管棉塞。火焰封口雙管。下一頁(yè)單一菌絲類型一級(jí)菌種接種無(wú)菌操作要點(diǎn)7將接種針靠在試管內(nèi)壁冷卻，然后挑取一小塊基內(nèi)菌絲瓊脂塊，迅速移接到空白斜面中央。棉塞燎考至微焦，塞回試管口上。右手用接種針伸入管內(nèi)挑，持住原始一級(jí)種試管，保持火焰封口狀態(tài)，左手將接好的試管放下，重新取一空白試管，重復(fù)上述操作，直至一級(jí)菌種用完為止。下一頁(yè)(2)本卷須知接種過(guò)程中，注意保持試管與桌面接近平行，試管口略向下傾斜，不要遠(yuǎn)離酒精燈火焰。周而復(fù)始。一支一級(jí)菌種可擴(kuò)展幾十支試管。氣生菌絲旺盛的菌類，如蘑菇、茯苓、，應(yīng)將氣生菌絲掉，用基內(nèi)菌絲移接。不同菌類移接用的接種塊大小與轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后菌種商品外觀和質(zhì)量有關(guān)。一般蘑菇、一級(jí)菌種轉(zhuǎn)管時(shí)，接種塊越小越好，這樣移接后氣生型菌絲不易倒伏。下一頁(yè)2混合型菌絲一級(jí)種的擴(kuò)大培養(yǎng)

銀耳純白菌絲生長(zhǎng)緩慢。為了單獨(dú)獲得銀耳純菌絲和為了提純羽毛狀菌絲，常在耳木別離時(shí)將兩種菌絲分別別離出，并分開擴(kuò)接。使用時(shí)從純白團(tuán)四周暈圈處鉤取小米粒大小帶培養(yǎng)基的菌絲體移入新培養(yǎng)基內(nèi)，24℃培養(yǎng)一周后，再在離銀耳純白菌絲團(tuán)外沿2cm處接入一小點(diǎn)羽毛狀菌絲，再繼續(xù)培養(yǎng)一周左右，就可以擴(kuò)接二級(jí)菌種。下一頁(yè)(二)二級(jí)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)1.單一菌絲類型二級(jí)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)將滅菌好的二級(jí)菌種培養(yǎng)瓶數(shù)十瓶(視接種箱的大小)連同接種工具、一級(jí)菌種放入接菌箱內(nèi)，按常規(guī)進(jìn)行熏蒸消毒。按無(wú)菌操作要求，在接種箱內(nèi)將接種針進(jìn)行火焰滅菌、冷卻。將一級(jí)菌塊劃成1㎝大小的接種塊，用接種鉤鉤住，彎鉤朝上，左手持二級(jí)菌種瓶橫放，用右手小指和魚際抓住棉塞，左手將二級(jí)種瓶反時(shí)針旋轉(zhuǎn)后退，撥脫棉塞，火焰封口。下一頁(yè)二級(jí)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)將已鉤取的菌種塊抖入二級(jí)菌種瓶，塞上棉塞。經(jīng)搖二級(jí)菌種瓶，使菌種塊滾至培養(yǎng)基面中央。按此法每支試管可接二級(jí)菌種瓶8～10瓶。操作時(shí)注意：不能將二級(jí)種瓶口朝上，同時(shí)注意撥出棉塞后，不能碰到其它器具及接種箱壁。假設(shè)接種塊掉在箱底上，應(yīng)棄之不用。每接完一支一級(jí)種，接種工具應(yīng)重新火焰滅菌。待整箱二級(jí)菌種瓶全部接完后，開啟箱蓋。下一頁(yè)2.混合型二級(jí)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)混合型原種的接種和單一型二級(jí)種接種的方法大同小異。顯著不同的是：銀耳一級(jí)種培養(yǎng)基的前后端應(yīng)棄之不用，僅要繡球狀銀耳純白菌絲及附近長(zhǎng)有黑灰色羽毛狀菌絲的菌塊。按上述方法，連同培養(yǎng)基整塊鉤取出，移入菌種瓶?jī)?nèi)，每支試管僅能接一瓶二級(jí)菌種，不能貪多。接完二級(jí)菌種，用手拍打，振動(dòng)瓶，使一級(jí)菌種塊純白菌絲面朝上，千萬(wàn)不能朝下，否那么報(bào)廢。下一頁(yè)混合型二級(jí)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)溫度初期27～28℃，促使羽毛狀菌絲蔓延，5～6天之后馬上降至22～23℃，這是純白菌絲生長(zhǎng)適宜的溫度。接種后培養(yǎng)20～25天，接種塊逐漸形成膠質(zhì)化的原基團(tuán)，并吐出水珠，適合作為段木銀耳種，菌齡控制在40～45天。假設(shè)在同樣的溫度下，12～13天膠化，并逐漸開片，吐黃水，那么適合作為代料棒栽銀耳種，菌齡控制在15～18天內(nèi)使用。下一頁(yè)(三)三級(jí)種擴(kuò)大培養(yǎng)三級(jí)種是用培養(yǎng)好的二級(jí)種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。1單一菌絲型三級(jí)種的接種待接栽培瓶橫放入接種箱左邊，選無(wú)污染的二級(jí)菌種瓶置于接種架上，同時(shí)將一團(tuán)浸有95%酒精的棉花團(tuán)，長(zhǎng)柄攝子、接種匙、接種架酒精燈、火柴等一起放入接種箱內(nèi)，按常規(guī)方消毒。接種時(shí)用長(zhǎng)柄攝子夾緊酒精棉花團(tuán)，翻開二級(jí)種瓶的棉花塞，將棉花團(tuán)點(diǎn)燃，在瓶口附近燃燒，進(jìn)行瓶口消毒，然后置于接種架上火焰封口。下一頁(yè)三級(jí)種擴(kuò)大培養(yǎng)然后接種匙火焰滅菌后將二級(jí)種外表的培養(yǎng)基扒掉，再將下面長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)基在瓶?jī)?nèi)挖碎。接種匙插放在二級(jí)菌種瓶?jī)?nèi)，置于接種架上，左手持三級(jí)種瓶，右手小指及手掌魚際夾住棉塞旋轉(zhuǎn)翻開，靠近二級(jí)種瓶口，然后用接種匙鏟取一滿匙，移入三級(jí)種瓶?jī)?nèi)，再塞緊棉塞，接種完畢，豎放在接種箱右邊。周而復(fù)始。接種完畢取出，貼上標(biāo)簽，輕振使一局部二級(jí)菌種塊落入種穴，一局部布滿外表。排入培養(yǎng)室。每瓶二級(jí)菌種可接25～30瓶三級(jí)種。下一頁(yè)2.混合型三級(jí)種的擴(kuò)大培養(yǎng)將待接三級(jí)種瓶及接種匙等工具放入接種箱內(nèi)，進(jìn)行常規(guī)消毒，其操作過(guò)程和上述單一菌絲型三級(jí)種擴(kuò)接一樣，最的不同點(diǎn)是：用接種匙將瓶?jī)?nèi)銀耳原基鏟平，挖出子實(shí)體原基，棄之，將子實(shí)體下面2～3cm內(nèi)較結(jié)實(shí)的菌絲塊，用接種匙搗碎。然后挖取耳基周圍幾匙的木屑，搗碎，兩者混合均勻。下一頁(yè)混合型三級(jí)種的擴(kuò)大培養(yǎng)接種匙鏟接量只需蠶豆大小，移入三級(jí)種瓶?jī)?nèi)，每瓶二級(jí)菌種可接3～4瓶三級(jí)種，其余棄之不用。因銀耳是混合型的，純白菌絲僅生長(zhǎng)在外表淺層培養(yǎng)基內(nèi)，又由于羽毛狀菌絲繁殖十分迅速，所以銀耳培養(yǎng)基裝料只需裝1/4瓶即可。移接中注意防止?fàn)C傷菌絲。返回二、貼標(biāo)簽一級(jí)種試管標(biāo)簽應(yīng)貼在前端，既不能遮住棉塞，又不遮住培養(yǎng)基斜面的部位，以免在檢查棉塞和斜面是否污染時(shí)千萬(wàn)不便；二級(jí)、三級(jí)種標(biāo)簽多貼在瓶上部側(cè)壁；塑料袋難貼標(biāo)簽，可將標(biāo)簽貼在塑料套環(huán)上。出可用記號(hào)筆將標(biāo)簽內(nèi)容寫在塑料袋外。標(biāo)簽內(nèi)容注明菌種名稱、菌株號(hào)、接種者或單位接種日期四項(xiàng)。菌種名可用中文注明，也常用拉丁文學(xué)名的縮寫注明。習(xí)慣上常用的縮寫字母。

下一頁(yè)貼標(biāo)簽菌種名多寫在標(biāo)簽的第一行，字體較大。菌株號(hào)是某一菌種特定菌株代號(hào)，更多的是用有一定代表意義的數(shù)字表示，它一般要求用較小號(hào)的字符寫在菌種之后。購(gòu)置一級(jí)菌種代號(hào)不宜自行更改。接種者或單位是注明該菌種制作責(zé)任人。接種日期菌種使用時(shí)作為推算菌齡的依據(jù)?？蒲猩?，育種上的標(biāo)簽一般較復(fù)雜，內(nèi)容較多，除上述內(nèi)容外，還要注明別離方法如孢子別離(S)、組織別離(T)、基內(nèi)菌絲別離(M)等。返回菌種培養(yǎng)培養(yǎng)室內(nèi)溫度、濕度、光照、空氣等條件彼此聯(lián)系，互相影響。1.溫度控制培養(yǎng)室內(nèi)溫度應(yīng)根據(jù)季節(jié)變化進(jìn)行控制，并結(jié)合培養(yǎng)階段確定培養(yǎng)溫度。(1)冬季保溫、夏季降溫冬季氣溫低，菌種培養(yǎng)室要有保溫措施，使培養(yǎng)室溫度保持在25℃左右，不保溫浪費(fèi)然。夏季菌種呼吸產(chǎn)生熱量，使培養(yǎng)室溫度升高，可達(dá)45℃，在這個(gè)溫度下培養(yǎng)的菌種，菌絲弱，有時(shí)還能造成菌種死亡，所以要有降溫措施。(2)變溫培養(yǎng)大多數(shù)的菌種菌絲體生長(zhǎng)階段25℃生長(zhǎng)最快，20℃以下菌絲最壯。我們目前大多培養(yǎng)菌種采用初期培養(yǎng)溫度26～28℃，這時(shí)氣溫雖然26～28℃，但菌種瓶或袋內(nèi)溫度低，有利于瓶或袋內(nèi)栽培料吸溫，菌種恢復(fù)的快；菌種培養(yǎng)中期(菌種恢復(fù)已封面并向下生長(zhǎng)幾厘米)培養(yǎng)溫度控制23℃，這時(shí)袋內(nèi)溫度比氣溫高2～3℃，袋內(nèi)溫度那么25℃，菌絲生長(zhǎng)最快；培養(yǎng)后期溫度控制在20℃以下，菌絲生長(zhǎng)最壯。下一頁(yè)菌種培養(yǎng)2.濕度控制培養(yǎng)室濕度最好控制在RH50%，不宜太濕，濕度過(guò)大，霉菌易繁殖。3.通風(fēng)換氣食用菌是好氣性真菌，菌絲體生長(zhǎng)階段需要充足的氧氣。通風(fēng)換氣消除呼吸過(guò)程產(chǎn)生的二氧化碳，通過(guò)氣體擴(kuò)散得到氧氣。同時(shí)通過(guò)通風(fēng)換氣排除呼吸過(guò)程產(chǎn)生的熱量。4.光菌絲體生長(zhǎng)階段不需要光線。培養(yǎng)室盡可能暗。5.污染的檢查培養(yǎng)過(guò)程中塑料袋制種最好不要經(jīng)常檢查是否有污染，檢查菌種時(shí)常常手提袋口，袋內(nèi)吸氣造成污染。檢查用工作燈照射，發(fā)現(xiàn)有污染的提出。下一頁(yè)第三節(jié)菌種質(zhì)量的鑒定菌種質(zhì)量的優(yōu)劣是一個(gè)非常嚴(yán)肅的問題。菌種生產(chǎn)必須首先保證質(zhì)量。一.一級(jí)菌種鑒定一是鑒定所別離得到的菌株或從外地引進(jìn)的菌株是不是我們所需要栽培的菌株。二是判別所得到的菌種是否優(yōu)良。常見幾種食用菌一級(jí)菌種主要特征(見附表)香菇、木耳、蘑菇、草菇、金針菇。下一頁(yè)二.二級(jí)或三級(jí)種的鑒定(一)木腐菌類的鑒定除銀耳外，以木屑作培養(yǎng)基的菌種，外觀上，菌絲潔白，濃密，木屑被分解后，逐漸從棕褐色轉(zhuǎn)為淡黃色，假設(shè)瓶?jī)?nèi)的菌絲柱和瓶壁脫離，說(shuō)明培養(yǎng)基偏干，培養(yǎng)室內(nèi)空氣相對(duì)濕度偏低或菌種老化。有時(shí)瓶底出現(xiàn)黃色分泌液，說(shuō)明菌種已完全老化。假設(shè)瓶袋內(nèi)下半部木屑未分解，仍為棕褐色，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間缺乏，需在培養(yǎng)，如菌種瓶或袋底份量較重，菌絲前端密集，生長(zhǎng)停滯，形成抑制線，這是由配料過(guò)濕所致。下一頁(yè)(二)草腐生菌類二、三級(jí)菌種的鑒定蘑菇和草菇均屬于草腐生菌類。其二、三級(jí)菌種形態(tài)差異較大，蘑菇又因菌株不同，出現(xiàn)較大的差異。蘑菇氣生型菌株菌絲旺盛，雪白，蔓延過(guò)程菌絲前端呈扇形展開，當(dāng)培養(yǎng)基過(guò)濕時(shí)，極易形成塊狀的菌皮。貼生型的菌株菌絲極為纖細(xì)，呈藍(lán)灰色，不易形成菌被。草菇菌種的菌絲為透明狀，銀灰色，生長(zhǎng)迅速，后期出現(xiàn)紅褐色的厚垣孢子。厚垣孢子少的，一般出菇的子實(shí)體大，反之那么小。下一頁(yè)(三)菌種的選購(gòu)具體的選購(gòu)方法歸納起來(lái)就是“提、聞、看〞提用手提棉塞，看棉塞松緊是否適度，過(guò)松過(guò)緊都不行。聞聞菌種的氣味，假設(shè)菌種散發(fā)出酸、霉、臭味，那么說(shuō)明菌種已污染，不是純培養(yǎng)菌絲。純培養(yǎng)菌種具有特殊香味?？纯淳N的外觀，看是否破管、破瓶、破袋，再看菌種是否否“純、正、壯、潤(rùn)〞具體來(lái)說(shuō)純度高，不能有雜菌；菌絲體色澤正，多數(shù)種類的菌絲應(yīng)純白、原種、栽培種菌絲連結(jié)成塊，無(wú)老化、變色、吐黃水、長(zhǎng)子實(shí)體原基等現(xiàn)象，菌絲粗壯，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)；培養(yǎng)體要濕潤(rùn)，含水量適宜，不干縮脫壁。下一頁(yè)第四節(jié)菌種的保藏一、繼代保存法繼代保存法是將所保存的菌株每間隔三～六個(gè)月，進(jìn)行菌絲前端切割，重新移植到新的培養(yǎng)基上，待菌絲蔓延一段時(shí)間后在稍低溫度下保存，一般為4～6℃，草菇菌種要在15℃以上保存。所保存的菌種在使用之前12～14小時(shí)從冰箱拿出，經(jīng)適溫培養(yǎng)恢復(fù)活力后，方能使用否那么不易成活。下一頁(yè)二、有關(guān)菌株的代數(shù)繼代代數(shù)各學(xué)者看法不同，一種看法是繼代次數(shù)多了，引起遺傳性質(zhì)退化，產(chǎn)量降低；另一種看法是