遺傳育種學(xué)課件：轉(zhuǎn)基因與生物安全性

轉(zhuǎn)基因與生物安全性轉(zhuǎn)基因與生物安全性第一節(jié) 概述第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理與方法第三節(jié)

外源基因整合、表達(dá)與遺傳第四節(jié) 轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的安全性第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展1982年，美Richard

D.

Palmiter等首次將大鼠生長(zhǎng)激素（GH）基因?qū)胄∈笫芫阎校@得了個(gè)體比大鼠大1倍的轉(zhuǎn)基因“超級(jí)鼠”，此后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得以飛速發(fā)展。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因通常是指在DNA操作過程中整合到動(dòng)、植物受體細(xì)胞染色體上的外源基因。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為了能夠使外源基因在動(dòng)、植物體內(nèi)穩(wěn)定展現(xiàn)出相應(yīng)的生物學(xué)表型，必須采用轉(zhuǎn)基因的重組子構(gòu)建技術(shù)、重組分子導(dǎo)入動(dòng)植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化技術(shù)、轉(zhuǎn)基因在受體細(xì)胞染色體上的穩(wěn)定整合及可控表達(dá)技術(shù)，這些技術(shù)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物育種上的應(yīng)用1984年朱作言等將小鼠重金屬螯合蛋白基因啟動(dòng)子與調(diào)控序列和人生長(zhǎng)激素基因的重組DNA注射到魚受精卵原核內(nèi)，培育出生長(zhǎng)速度快的轉(zhuǎn)基因魚，證明了外源基因可在受體魚內(nèi)整合、表達(dá)、促生長(zhǎng)，并通過性腺傳遞給子代，建立了世界上首例轉(zhuǎn)基因魚模型。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物育種上的應(yīng)用快速育種傳統(tǒng)的品種選育需經(jīng)過多代反復(fù)選種交配才能育成優(yōu)良品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可能在很短時(shí)間內(nèi)超越自然界億萬年生物進(jìn)化歷程，創(chuàng)造自然界原來沒有的品種或品系；改良養(yǎng)殖性能加快受體生長(zhǎng)、提高餌料利用率及抗逆性等。轉(zhuǎn)基因魚生長(zhǎng)速度可提高11%～30%，即

“超級(jí)魚”

。第一節(jié)

概述轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物育種上的應(yīng)用生產(chǎn)醫(yī)藥生物制品利用海水養(yǎng)殖生物生產(chǎn)基因工程口服藥物和疫苗，既能利用海洋生物量大、生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，又能避免表達(dá)后提取、純化的復(fù)雜性（攜帶人胰島素的轉(zhuǎn)基因魚以提供胰島素）；轉(zhuǎn)基因魚的育性控制不育的轉(zhuǎn)基因魚或雌核發(fā)育轉(zhuǎn)基因魚，是解決轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)入天然水域后對(duì)同類或可交配的近親種類的遺傳背景產(chǎn)生影響和干擾的好辦法第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理與方法外源基因的表達(dá)和檢測(cè)外源基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的主要技術(shù)外源基因的構(gòu)建第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理與方法一、外源基因的構(gòu)建外源基因啟動(dòng)子目的基因轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(一)、啟動(dòng)子病毒基因啟動(dòng)子: 猴空泡病毒啟動(dòng)子（SV40）和禽肉瘤病毒啟動(dòng)子（RSV）高等動(dòng)物啟動(dòng)子和增強(qiáng)子：如小鼠金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子（mMT）魚類基因啟動(dòng)子：

如β肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因啟動(dòng)子、抗凍蛋白啟動(dòng)子（AFP）、鯉金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子(二)、目的基因目的基因生長(zhǎng)激素(GH)基因增加抗逆性的基因抗凍蛋白(AFP)基因抗病性基因珠蛋白基因報(bào)告基因(二)、目的基因生長(zhǎng)激素（GH）基因魚類轉(zhuǎn)基因研究的第一個(gè)熱點(diǎn)：①

獲得生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高的“超級(jí)魚”；②

對(duì)各種動(dòng)物和人的生長(zhǎng)激素及其基因序列都已研究清楚，并且用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了許多含mMT啟動(dòng)子和生長(zhǎng)激素基因的質(zhì)粒，為各種動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究和實(shí)踐準(zhǔn)備了現(xiàn)成的材料；③

很多實(shí)驗(yàn)都證明哺乳類和魚類的生長(zhǎng)激素注射到魚體后，不僅能產(chǎn)生明顯的促生長(zhǎng)作用，而且還能提高某些魚類對(duì)水體鹽度的適應(yīng)力和飼料轉(zhuǎn)換系數(shù)。(二)、目的基因生長(zhǎng)激素（GH）基因第一代轉(zhuǎn)基因魚：哺乳類或家畜的生長(zhǎng)激素基因遠(yuǎn)源基因存在著在受體魚細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控與生物學(xué)效應(yīng)以及轉(zhuǎn)基因魚消費(fèi)安全等問題第二代轉(zhuǎn)基因魚：“全魚”基因、“自源基因”

(autotransgenic)除安全性外，“全魚”結(jié)構(gòu)還可提高轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)水平(二)、目的基因轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素（GH）基因?qū)嵗鼶u（1992

）用美洲大綿鳚啟動(dòng)子opAFP和大鱗大麻哈魚GH基因構(gòu)成的融合基因轉(zhuǎn)移到大西洋鮭受精卵中，獲得轉(zhuǎn)基因魚個(gè)體的體重比對(duì)照組平均要大3.8倍，標(biāo)志著第二代轉(zhuǎn)基因魚的誕生；最戲劇性的轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因“超魚”來自Devlin

等(1994,Nature

371)

的報(bào)道,結(jié)果表明轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因魚平均體重比對(duì)照平均體重高11

倍,

最大個(gè)體體重比對(duì)照最大個(gè)體體重大37

倍。(二)、目的基因轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素（GH）基因?qū)嵗琪V:

Robert

H.Devlin,

2001,Nature(二)、目的基因抗凍蛋白(AFP)基因魚類轉(zhuǎn)基因研究的第二個(gè)熱點(diǎn)：抗凍蛋白（anti-freeze

proteins,

AFP）具有降低胞內(nèi)溶液凝固點(diǎn)的作用，存在于美洲黃蓋鰈等寒冷水域的魚體內(nèi)；把AFP基因轉(zhuǎn)移到缺乏該基因的魚（各種熱帶經(jīng)濟(jì)魚類如羅非魚等）中，以提高這些魚類的抗寒能力，從而擴(kuò)大這些魚類的養(yǎng)殖地域及節(jié)省越冬期間的能量消耗，為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供新的品質(zhì)優(yōu)良的品種。(二)、目的基因抗凍蛋白(AFP)基因目前已從美洲擬鰈、黃蓋鰈、瓦氏雅羅魚等魚類中分離并克隆出AFP基因。轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因金魚：紐芬蘭大洋條鱈AFP基因注入金魚受精卵中；轉(zhuǎn)抗凍蛋白基因鯽魚：美洲大綿鳚AFP基因轉(zhuǎn)入鯽魚(二)、目的基因抗病性基因抗微生物成分基因如轉(zhuǎn)昆蟲抗菌肽、溶菌酶等用于轉(zhuǎn)基因研究；轉(zhuǎn)抗菌肽Cecropin

B基因的斑點(diǎn)叉尾鮰、斑馬魚與對(duì)照魚相比均顯示具有較強(qiáng)的抗病原菌的能力；轉(zhuǎn)雞溶菌酶基因的斑馬魚F2的溶菌活力是對(duì)照魚的1.75倍(二)、目的基因報(bào)告基因（reporter

gene）所謂報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CAT，熒光素酶基因luc

，綠色熒光蛋白GFP基因(二)、目的基因報(bào)告基因（reporter

gene）因?yàn)閳?bào)告基因的表達(dá)易于量化和定位，主要用來研究外源基因在受體水產(chǎn)動(dòng)物，尤其是在模式水產(chǎn)動(dòng)物中的整合和表達(dá)，對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物中的行為并進(jìn)行理論上的探討。某些報(bào)告基因不但可以用于監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)，還可用于新型觀賞魚的開發(fā)

。(二)、目的基因報(bào)告基因（reporter

gene）轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚作為觀賞魚已于2004年初在美國(guó)（除加洲外）市場(chǎng)上銷售，轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚成為第一種上市的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物二、

外源基因的導(dǎo)入顯微注射法電穿孔法精子載體法脂質(zhì)體法逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染基因槍法I. 顯微注射法借助于顯微鏡的放大技術(shù)，直接把外源基因注射到動(dòng)物的卵母細(xì)胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞中，然后生產(chǎn)動(dòng)物個(gè)體的方法。優(yōu)點(diǎn)：整合率高缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、操作技術(shù)難度大，每次注射有限細(xì)胞I. 顯微注射法II. 電穿孔法在瞬間高壓下，細(xì)胞膜形成可逆的細(xì)胞膜孔，DNA經(jīng)由細(xì)胞膜孔而進(jìn)入細(xì)胞中，當(dāng)電場(chǎng)消逝后細(xì)胞膜可在回復(fù)，使DNA保留在細(xì)胞內(nèi)優(yōu)點(diǎn)：可一次處理大量樣品缺點(diǎn)：高壓易使受精卵受到傷害；導(dǎo)入是隨機(jī)的、無定向性，而且轉(zhuǎn)移率較低。III. 精子載體法spermmediatedgene

transfer將目的基因利用電穿孔方式送入精子，而后再利用體外受精的方式使精子與卵結(jié)合，通過重組作用使遺傳物質(zhì)繁衍至下一代III. 精子載體法spermmediatedgene

transfer利用精子攜帶電脈沖法對(duì)大珠母貝和合浦珠母貝進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究，陽性率達(dá)50%；聚乙烯亞胺(PEI)與精子載體法相結(jié)合在將外源基因轉(zhuǎn)入皺紋盤鮑；Tsai等用電脈沖介導(dǎo)的精子載體法將外源基因(opAFP2000CAT)

導(dǎo)入雜色鮑中，陽性率達(dá)65%IV. 脂質(zhì)體法

lipofection脂質(zhì)體:

人造脂質(zhì)小泡，在水中磷脂分子親水頭部插入水中，疏水尾部伸向空氣，攪動(dòng)后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體，可將外源DNA包裝在內(nèi)部，通過雙層膜同受體細(xì)胞膜間的融合作用，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，再進(jìn)入細(xì)胞核，完成基因轉(zhuǎn)移IV. 脂質(zhì)體法

lipofection優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單方便缺點(diǎn)：要多次重復(fù)測(cè)試才能找到最適宜轉(zhuǎn)染條件V. 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染Virusmediatedgene

transfer病毒具感染宿主細(xì)胞能力，可將目的基因嵌入適當(dāng)病毒載體中；此載體在感染細(xì)胞或胚胎時(shí)，將外源基因帶入基因組中優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，一次可處理眾多樣品缺點(diǎn)：外源基因在生殖細(xì)胞系中的遺傳率低于顯微注射VI.

基因槍Gunpowder將包裹DNA的金?；蜴u粒，通過基因槍（火藥爆炸或高壓氣體加速）、氦氣或電擊等技術(shù)來獲得足夠的加速度，射入完整的植株、組織外植體、愈傷組織或細(xì)胞懸液高效，但是整合率非常低VI.

基因槍Gunpowder劉志毅等（2001）:含猿猴空泡病毒啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白基因(GFP)和核酶基因的質(zhì)粒pGTR導(dǎo)入蝦卵，通過顯微熒光觀察和RT-PCR檢測(cè)，得到了轉(zhuǎn)GFP基因的中國(guó)對(duì)蝦幼體第三節(jié) 外源基因整合、表達(dá)與遺傳一、外源基因整合（一）外源基因的命運(yùn)一般在胚胎發(fā)育早期受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量的復(fù)制，復(fù)制以后經(jīng)歷部分降解、變構(gòu)、多聚化和逐漸與基因組整合的過程。整合：有效整合，無效整合或沉默表達(dá)，毒性整合第三節(jié) 外源基因整合、表達(dá)與遺傳一、外源基因整合（二）隨機(jī)整合外源DNA引入細(xì)胞基因組，絕大多數(shù)情況下發(fā)生DNA隨機(jī)整合，是一種非常規(guī)重組；一、外源基因整合（二）隨機(jī)整合

外源DNA整合的構(gòu)型“循環(huán)排列線狀”分子模型：DNA分子的環(huán)化；環(huán)化分子的隨機(jī)切開；形成一系列循環(huán)排列的線狀分子；同源交換，形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)一、外源基因整合（二）隨機(jī)整合整合效率外源基因注入受精卵后可與受體基因組整合，整合率與受體魚種類、注入方式、注入DNA的構(gòu)型以及劑量有關(guān)。整合特點(diǎn)通常插入染色體的一個(gè)位點(diǎn)，少數(shù)情況插入幾個(gè)位點(diǎn)；形成轉(zhuǎn)基因嵌合體（占65%）；整合的隨機(jī)性和拷貝數(shù)的變異性。一、外源基因整合（三）同源重組（基因打靶）通過外源DNA與靶位點(diǎn)上相同核苷酸序列的同源重組，使外源基因穩(wěn)定地插入預(yù)定的位點(diǎn)。GeneknockinGeneknock

out通過基因打靶技術(shù)，在胚胎干細(xì)胞上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移、篩選，克隆穩(wěn)定整合的細(xì)胞，以此細(xì)胞再作核移植，有望獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因魚，從根本上解決轉(zhuǎn)基因的定點(diǎn)整合與可控表達(dá)。二、外源基因的表達(dá)整合位置不同,

轉(zhuǎn)入基因有不同的表達(dá)：如整合在封閉的染色質(zhì)區(qū)很少或幾乎不表達(dá)；若整合在活化的染色質(zhì)區(qū)域，可能會(huì)高效表達(dá)；整合的轉(zhuǎn)入基因拷貝數(shù)的不同也能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平不同導(dǎo)入基因的不確定性與遺傳的不可預(yù)見性：受體中整合的量及部位不同，又缺少調(diào)控手段，外源基因在受體中的表達(dá)也是不確定的；產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因魚畸形多，在其后代中具有的外源基因拷貝數(shù)目也不一樣，發(fā)生分離，優(yōu)良性狀不能穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有不可預(yù)見性第三節(jié) 外源基因整合、表達(dá)與遺傳目前，國(guó)內(nèi)外已克隆出20多種魚的GH基因，構(gòu)建出10多個(gè)“全魚”重組基因模型；轉(zhuǎn)基因遺傳不穩(wěn)定問題: 基因打靶+克隆+核移植，獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因魚；定點(diǎn)整合、穩(wěn)定遺傳、穩(wěn)定與可控表達(dá)以及安全性問題，仍是今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相同本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因進(jìn)行遺傳改良區(qū)別在生物種內(nèi)個(gè)體間的基因轉(zhuǎn)移不受生物體間親緣關(guān)系的限制整個(gè)基因組的操作和轉(zhuǎn)移明確定義的基因的轉(zhuǎn)移第四節(jié)

轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的安全性一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展1、在全球1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物—一種含有抗生素藥類抗體的煙草在美國(guó)成功培植；1993年世界上第一種轉(zhuǎn)基因食品—轉(zhuǎn)基因晚熟西紅柿正式投放美國(guó)市場(chǎng)；2009

年，25

個(gè)國(guó)家的1400

萬農(nóng)民種植了1.34

億公頃（3.3億英畝）轉(zhuǎn)基因作物，相比2008

年1330

萬農(nóng)民種植1.25

億公頃有所上升（7%）。一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國(guó)際服務(wù)組織（ISAAA）執(zhí)行綱要簡(jiǎn)報(bào)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展1996-2009年，種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家由6個(gè)增加到25個(gè)。一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展2、在中國(guó)2009年，種植面積突破370萬公頃，成為繼美國(guó)、阿根廷、巴西、印度、加拿大之后的轉(zhuǎn)基因作物種植大國(guó)。正在研究的轉(zhuǎn)基因生物有130多種，涉及的基因種類超過100種。1993年，發(fā)布了基因工程安全管理相關(guān)法規(guī)。2001年，國(guó)務(wù)院發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展2、在中國(guó)2009

年11

月：中國(guó)為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）和植酸酶玉米（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所）頒發(fā)了生物安全證書。二、轉(zhuǎn)基因生物是柄“雙刃劍”？對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭(zhēng)論，國(guó)際上有幾個(gè)典型的事件。Pusztai事件；斑蝶事件；1995加拿大“轉(zhuǎn)基因油菜超級(jí)雜草”事件；2001墨西哥玉米基因污染《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，2001年5月9日實(shí)施。《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)估管理辦法》，2002年3月20日起實(shí)施，第一次將轉(zhuǎn)基因從低到高分為4個(gè)等級(jí)?！掇r(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》，2002年3月20日起實(shí)施。《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，2002年3月20日起實(shí)施，規(guī)定對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)制度。第一批標(biāo)識(shí)管理的轉(zhuǎn)基因生物目錄是：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花種子、番茄種子、鮮番茄、番茄醬?！掇D(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》，2002年4月8日頒布，7月1日起實(shí)施?！哆M(jìn)出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫管理辦法》，2004年6月12日頒布。三、轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)生物尚待解決的問題1、外源基因轉(zhuǎn)移可控性和穩(wěn)定的遺傳性2、轉(zhuǎn)基因魚的安全評(píng)價(jià)受體魚的安全性調(diào)查基因操作過程的安全性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生態(tài)安全性遺傳安全性食用安全性遺傳和生態(tài)安全問題1）

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物逃逸或釋放到外界環(huán)境后，與野生物種進(jìn)行交配，導(dǎo)致外源基因的擴(kuò)散，改變物種原有的基因組成，造