第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞生物學(xué)

CellBiology伊犁師范學(xué)院編輯課件

課程內(nèi)容第一章緒論第二章細(xì)胞根本知識概要第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法第四章細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞外表第五章 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與內(nèi)膜系統(tǒng)第六章細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換第七章細(xì)胞核與染色體第八章 細(xì)胞增殖及其調(diào)控第九章核糖體第十章細(xì)胞骨架第十一章細(xì)胞分化與基因表達(dá)調(diào)控第十二章細(xì)胞衰老與凋亡編輯課件第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法伊犁師范學(xué)院生物與園林教研室何春霞制作編輯課件

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)細(xì)胞生物學(xué)CellBio編輯課件第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法顯微鏡和顯微鏡的分辨能力肉眼：0.2mm;光鏡：0.2um;電鏡：0.2nm編輯課件Microscopytechnologies

Lightmicroscopy(1600’s)

Brightfield

Phasecontrast

Nomarski

Electronmicroscopy(1930’s)

ScanningEM

TransmissionEM

Fluorescencemicroscopy(1911)

Fluorescence

Deconvolution Confocal

01_06_Whatcanwesee.jpgSizerangeoftypicalcells?Typicalmolecule?編輯課件01_09_Scale.jpg編輯課件01_07_Internalstructures.jpgInternalstructuresofcellcanbeseenwithlightmicroscope編輯課件一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)二、電了顯微鏡技術(shù)三、掃描隧道顯微鏡(STM)編輯課件普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡〔lightmicroscope〕熒光顯微鏡〔fluorescencemicroscope〕激光共聚焦顯微鏡〔laserscanningconfocalmicroscope〕相差顯微鏡〔phase-contrastmicroscope〕〔光程差或相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睿嗖畎濉澄⒎指深A(yù)顯微鏡〔differential-interferencemicroscope〕一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)編輯課件1、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡〔最大分辨率為0.2μm〕，主要由三局部組成：①光學(xué)放大系統(tǒng)，即目鏡和物鏡；②照明系統(tǒng)；③機(jī)械和支架系統(tǒng)。

編輯課件編輯課件D=0·61λN·sinɑ/2λ:光源波長;α:物鏡鏡口角;N:介質(zhì)折射率顯微鏡的性能優(yōu)劣決定于它的分辨率。分辨率是指顯微鏡區(qū)分開相近兩點(diǎn)的能力。

編輯課件Stainedtissuesectionshowingurine-collectingDuctsinthekidneyStainedwithhematoxylinandeosinDuctcomposedofcloselypackedcellsNucleistainedredExtracellularmatrixstainedblue編輯課件2、熒光顯微鏡技術(shù)FluorescenceMicroscopy

在紫外光顯微鏡根底上開展而來，利用樣品自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光，可以對某些生物大分子進(jìn)行定性和定位研究。不僅可以觀察固定切片標(biāo)本，還可以在活體染色后對活細(xì)胞進(jìn)行研究。

編輯課件熒光顯微鏡及其照片微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色編輯課件FluorescentImageofaCellinMitosisSpindlemicrotubulesrevealedwithagreenfluorescentantibody

Centromeres–redfluorescentantibodyDNA–bluefluorescentdye編輯課件

激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)。共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)以及亞細(xì)胞形態(tài)和組分。3、激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡技術(shù)

laserconfocalscanningmicroscope編輯課件激光共聚焦原理編輯課件激光共聚焦掃描顯微鏡編輯課件LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)編輯課件Amitoticfertilizedeggfromseaurchin

編輯課件4、相差顯微鏡技術(shù)Phase-contrastmicroscopy相差顯微鏡由P．Zernike于1932年創(chuàng)造，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。特點(diǎn)：樣品不需染色，適合觀察活細(xì)胞。甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動態(tài)。

編輯課件編輯課件Brightfieldandphasecontrast編輯課件5微分干預(yù)顯微鏡技術(shù)Differentialinterferencemicroscopy(DIC)微分干預(yù)顯微鏡用的是偏振光，增加了樣品反差，并具有立體感，可作于研究活體細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。

編輯課件編輯課件〔一〕電了顯微鏡根本知識

分辨率最終決定于光的波長，由于使用電子束作光源，電鏡的分辨率大大提高。電鏡的分辨率常常是超薄切片厚度的1/10，它的分辨率可達(dá)0.2nm，其放大倍數(shù)為106倍。

二、電了顯微鏡技術(shù)編輯課件電鏡的根本構(gòu)造包括：

①電子束照明系統(tǒng)；②電磁透鏡成像系統(tǒng)；③真空系統(tǒng)；④記錄系統(tǒng)；⑤電源系統(tǒng)。編輯課件

光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡發(fā)光源燈泡電子槍光源可見光、紫外光電子束透鏡玻璃透鏡電磁透鏡真空系統(tǒng)空氣真空成象色彩彩色單色標(biāo)本制作石蠟、冰凍切片超薄切片光鏡顯微鏡與電子顯微鏡的比較編輯課件編輯課件

〔二〕主要電鏡制樣技術(shù)介紹

主要的用于觀察生物樣品的電鏡技術(shù)有：①超薄切片技術(shù)；是觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的根底。②負(fù)染色技術(shù)；③冷凍斷裂和冷凍蝕刻電鏡技術(shù)技術(shù)；④電鏡三維重構(gòu)技術(shù)；⑤掃描電鏡技術(shù)〔SEM〕；是觀察細(xì)胞外表形貌的有力工具。編輯課件

樣品制備技術(shù)的特殊要求：①樣品要??；②更好地保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)；③樣品具有一定的反差。編輯課件1.超薄切片

通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差編輯課件切片流程圖超薄切片技術(shù)編輯課件超薄切片機(jī)編輯課件Electronmicrographofacellinaroottip編輯課件Transmissionelectronmicrographofalivercellincrosssection編輯課件2.負(fù)染技術(shù)負(fù)染就是用重金屬鹽〔如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾〕對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；吸去染料，樣品枯燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方那么沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。編輯課件3.冰凍蝕刻〔freeze-etching〕

冰凍蝕刻亦稱冰凍斷裂〔freeze-fracture〕。標(biāo)本置于-100°C的干冰或-196°C的液氮中，進(jìn)行冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻〔etching〕。

編輯課件蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)編輯課件編輯課件4.掃描電子顯微鏡〔scanningelectronmicroscope，SEM〕掃描電子顯微鏡于20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本的外表結(jié)構(gòu)。原理：次級電子光信號電信號顯示出與電子束同步的掃描圖像。作用：主要用于觀察樣品外表的形貌特征。編輯課件編輯課件是一種探測微觀世界物質(zhì)外表形貌的儀器，在納米生物學(xué)的研究領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)越性。STM的特點(diǎn)：①具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)；②可在真空、大氣、液體等條件下工作；③非破壞性測量。三、掃描隧道顯微鏡(STM)編輯課件透射電子顯微鏡JEM-1011透射電子顯微鏡編輯課件透射電鏡編輯課件第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、高速、超速和梯度密度離心別離各種細(xì)胞器、生物大分子及其復(fù)合物利用多種方法使細(xì)胞崩解，形成細(xì)胞器和細(xì)胞組分的混合勻漿，再通過差速離心，即利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開。差速離心與密度梯度離心相結(jié)合可以到達(dá)精確的別離。編輯課件差速離心編輯課件編輯課件

各種生物大分子蔗糖中的密度

名稱密度g/cm3

質(zhì)膜1.06-1.10光滑的內(nèi)質(zhì)膜網(wǎng)1.06高爾基器、高爾基體1.16完整致癌病毒1.16-1.18線粒體1.19溶酶體1.21過氧化物的酶體1.23植物病毒1.30-1.45可溶性蛋白1.30腸道病毒1.30-1.45核蛋白、核酸、核糖體1.60-1.75糖原1.70

編輯課件二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類、脂類的顯色DNA：福爾根〔Feulgen〕反響－－紫紅色Schiff試劑是由堿性品紅和亞硫酸鈉配制而成?？梢院腿┗错懶纬勺霞t色的溶液。在生物實(shí)驗(yàn)可以和經(jīng)過酸化的DNA發(fā)生反響，DNA被染成紫紅色，而不和核仁，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生反響，因此可以來鑒定DNA的存在。編輯課件多糖類：PAS反響－－紅色過碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，能將葡萄糖中乙二醇基〔CHOH-CHOH〕氧化成二個(gè)游離醛基〔—CHO〕，游離醛基與Schiff試劑反響生成紫紅色產(chǎn)物，顏色深淺與多糖含量成正比。編輯課件脂肪：蘇丹III－－紅色編輯課件蛋白質(zhì)：米倫〔Millon〕反響－－紅色蛋白質(zhì)溶液中參加米倫試劑〔亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液〕，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱那么變?yōu)榧t色沉淀，此反響為酪氨酸的酚核所特有的反響，因此含有酪氨酸的蛋白質(zhì)均呈米倫反響。還有哪些顯色方法？編輯課件

免疫熒光和免疫電鏡是最常用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位技術(shù)。1、免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)就是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合研究特異蛋白質(zhì)抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。三、特異蛋白質(zhì)抗原的定位與定性編輯課件2、免疫電鏡技術(shù)

免疫電鏡技術(shù)使特異蛋白的定位與超微結(jié)構(gòu)結(jié)合起來，使抗原定位更準(zhǔn)確。如蛋白分泌的研究胞內(nèi)酶的研究；一些結(jié)構(gòu)蛋白的研究。免疫電鏡技術(shù)可分為免疫鐵蛋白技術(shù)，免疫酶標(biāo)技術(shù)，免疫膠體金技術(shù)。編輯課件膠體金

是由氯金酸在復(fù)原劑作用下，聚合成特定大小的金顆粒，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。

膠體金在弱堿環(huán)境種帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)的正電荷結(jié)合，不影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。編輯課件1、原位雜交技術(shù)用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特殊核苷酸序列在染色體上或細(xì)胞中的位置的方法。2、Southern技術(shù)〔了解〕蛋白樣品經(jīng)電泳后，與DNA探針進(jìn)行吸附，與DNA有親合作用的蛋白帶被顯示出來。3、PCR技術(shù)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性編輯課件原位雜交技術(shù)編輯課件