高粱花葉病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程

1DB53/TXXXX—2022高粱花葉病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了高粱花葉病毒RT-PCR檢測方法中涉及的儀器與耗材、試劑、檢測樣品的取樣及對照設(shè)置、檢測方法和結(jié)果判定等。本文件適用于高粱花葉病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）侵染的植物樣品的RT-PCR檢測。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1高粱花葉病毒Sorghummosaicvirus高粱花葉病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），是引起甘蔗花葉病的主要病毒之一，英文名稱為Sorghummosaicvirus，縮寫為SrMV，參見附錄A。3.2RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR）的簡稱，是一種在體外利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，以獲得RNA特定片段。4儀器與耗材4.1儀器主要儀器包含電子天平、恒溫水浴鍋、高速臺式冷凍離心機、蛋白/核酸分析儀、PCR擴增儀、渦旋混勻器、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀、可調(diào)微量移液器、研缽等。4.2耗材無核酸酶（Nuclease-free）的1.5mL和2.0mL離心管及0.2mLPCR管等。5試劑5.1常規(guī)試劑液氮、焦碳酸二乙酯（DEPC）滅菌水或者RNase-free水、植物總RNA提取試劑盒、三氯甲烷、70%乙醇、異丙醇、無水乙醇等。2DB53/TXXXX—20225.2RT-PCR試劑Oligo(dT)18引物（0.5μg/μL），RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，含溴酚藍染料的2×EasyTaqPCRSuperMix聚合酶混合物。5.3引物5.3.1上游引物SrMV-F：5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′，下游引物SrMV-R：5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′（R=A/G，Y=C/T）。5.3.2用無核酸酶的水將上、下游引物分別配制成濃度為20μM的水溶液。5.3.3目的擴增片段約為820bp。5.4電泳緩沖液的配制按以下步驟配制電泳緩沖液：a)稱取242g的Tris，先用300mL的ddH2O攪拌溶解后，加100mL0.5mol/L的EDTA水溶液配制50×TAE儲存液；b)用ddH2O將儲存液稀釋50倍配制1×TAE工作液；c)稱取Tris108g、硼酸55g、7.44g的Na2EDTA·2H2O，加入40mL0.5mol/L的EDTA水溶液，再用ddH2O定容至1000mL配制10×TBE儲存液；d)用ddH2O將儲存液稀釋20倍配制0.5×TBE工作液。5.5擴增產(chǎn)物電泳檢測試劑1%左右（W/V）瓊脂糖，核酸染料。6檢測樣品的取樣及對照設(shè)置6.1陽性對照以SrMV侵染的植物樣品作為陽性對照。6.2陰性對照以健康植物樣品作為陰性對照。6.3空白對照以滅菌ddH2O作為空白對照。6.4取樣戴一次性手套采集甘蔗葉片或芽作為待檢樣品，且每采一個樣品跟換一次手套，過程中不應(yīng)交叉污將采的集樣品放入自封袋中，編號，冷藏運輸?shù)綄嶒炇乙旱賰龊?，?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?檢測方法7.1總RNA提取總RNA提取步驟如下：3DB53/TXXXX—2022a)戴一次性手套稱取0.1g待測樣品置于滅菌研缽中，液氮冷凍，研磨至粉狀后放入1.5mL離心管中，并對每支管進行編號；b)用核酸提取試劑盒提取樣品總RNA，按提取試劑使用說明書進行操作；c)提取后用蛋白/核酸分析儀測定RNA相對濃度，當A260/A280比值為1.8～2.0時，可用于RT-PCR檢測。7.2反轉(zhuǎn)錄按以下步驟進行反轉(zhuǎn)錄：a)以提取的總RNA為模板，在PCR管中按序依次加入：Oligo(dT)18引物約0.5μL、RNA模板約2.0μL（約200ng）、反轉(zhuǎn)錄試劑、滅菌DEPC水補足10μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，混勻；b)2000rpm快速離心10s，放入PCR儀合成cDNA，按RT-PCR試劑盒說明書進行操作。7.3PCR擴增按以下步驟進行PCR擴增：a)以合成的cDNA第一鏈為模板，在PCR管中按序依次加入：滅菌DEPC水7.2μL、含溴酚藍染料的2×EasyTaqPCRSuperMix聚合酶混合物10μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）2.0μL、0.4μL上游引物SrMV-F（20μM）、0.4μL下游引物SrMV-R（20μM制成20μLPCR反應(yīng)體系，2000rpm快速離心10s混勻后放進PCR儀進行PCR擴增；b)94℃預(yù)變性5min；c)94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；d)72℃延伸10min。7.4瓊脂糖凝膠電泳檢測按以下步驟進行：a)用1×TAE或0.5×TBE緩沖液配制1.0%左右（W/V）瓊脂糖膠，加熱至瓊脂糖完全熔化；b)待凝膠冷卻至50℃~60℃時，在100mL瓊脂糖膠中加入適量的核酸染料，混勻；c)將凝膠倒入置有樣品梳的制膠板上；d)待凝膠充分冷卻后，拔除樣品梳，將制膠板同制好的瓊脂糖凝膠一并放入裝有1×TAE或0.5×TBE電泳緩沖液的水平電泳槽；e)每個樣品取10μLPCR擴增產(chǎn)物加入樣品梳孔，在其中一個樣品梳孔中加入6μLDNA分子量標準（MarkerE），130V恒定電壓下電泳25min；f)電泳結(jié)束后，把膠板取出用凝膠成像儀觀察、拍照。8結(jié)果判定陽性對照在820bp左右有條帶，陰性對照和空白對照無條帶，則檢測結(jié)果有效。RT-PCR檢測結(jié)果判定詳見表1。4DB53/TXXXX—2022表1RT-PCR檢測結(jié)果判定RT-PCR產(chǎn)物在820bp左右有無條帶出現(xiàn)（參見1無無有有檢測結(jié)果有效，被檢測甘蔗樣品感染高粱花2無無有無檢測結(jié)果有效，被檢測甘蔗樣品未感染高粱3無檢測結(jié)果無效，將實驗中的所有試劑更換，測5DB53/TXXXX—2022（資料性）高粱花葉病毒A.1高粱花葉病毒高粱花葉病毒（Sorghummosaicvirus）屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員，英文名稱為Sorghummosaicvirus，縮寫為SrMV。A.2病原特征A.2.1病毒粒體SrMV病毒粒體呈彎曲線狀，無包膜，螺旋對稱結(jié)構(gòu)，大小為（750～850）nm×（13～15）nm。A.2.2基因組基因組由一條正單鏈RNA組成，大小約10kb，編碼一個多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶水解后可產(chǎn)生10個成熟的蛋白質(zhì)，從N端到C端依次是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP，還在P3氨基端編碼區(qū)發(fā)生移碼翻譯出P3N-PIPO。A.3寄主在自然條件下，SrMV可侵染甘蔗（Saccharumoficinarum）、高粱（Sorghumbicolor）、玉米（Zeamays）和細葉芒（Miscanthussinensis）等禾本科植物。A.4病害癥狀SrMV侵染為害葉片，花葉癥狀主要表現(xiàn)在葉片上，尤以新葉基部癥狀最為明顯；病毒可系統(tǒng)侵染，導(dǎo)致整叢蔗株發(fā)病，葉色褪綠，產(chǎn)生許多與葉脈平行的黃綠相間不規(guī)則條紋，大小長短不一，布滿葉片，與正常部分參差間隔成“花葉”；病株生長差、矮化、分蘗少，汁液量減少。A.5傳播途徑SrMV可通過帶毒的無性繁殖材料（種質(zhì)）、田間病株及種傳等方式傳播，可通過收獲機械、刀具和摩擦接種等方式傳播，也可被多種蚜蟲（甘蔗棉蚜Ceratovacunalanigera、黑豆蚜Aphiscraccivora、桃蚜Myzuspersicae和玉米蚜Rhopalsiphummaidis）以非持久方式傳播。A.6分布主要分布于印度、美國、巴西、阿根廷