器官培養(yǎng)課件

器官培養(yǎng)主要指植物根、莖、葉、花及小果實的無菌培養(yǎng)。器官培養(yǎng)的特點在于能保持它們所具有的特征性結(jié)構(gòu)，通過器官培養(yǎng)可快速大量地繁殖。目前這一技術(shù)已在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。本章將介紹離體根的培養(yǎng)、莖的培養(yǎng)和葉的培養(yǎng)。

第七章器官培養(yǎng)第一節(jié)根的培養(yǎng)

離體根的培養(yǎng)，由于具有生長迅速、代謝活躍及在已知條件下可根據(jù)需要增減培養(yǎng)基中的成分等優(yōu)點，多用于探索植物根系的生理及其代謝活動。

一、培養(yǎng)過程

現(xiàn)以番茄根為例，介紹其培養(yǎng)過程（圖6-1）。番茄種子經(jīng)表面消毒，在無菌條件下萌發(fā)，待根伸長后，從根尖一端切取10mm長的根尖接種于培養(yǎng)基中。

圖7-1番茄離體根培養(yǎng)的過程1

、種子用70%酒精消毒1分鐘；2、用飽和漂白粉液消毒10分鐘；3、用無菌水洗三次；4、將6～10粒種子放入培養(yǎng)皿中的濕濾紙上；5.培養(yǎng)皿放入暗中培養(yǎng)直至胚根長至30～40mm；6.切取10mm長的根尖用無菌的接種環(huán)接種于培養(yǎng)液中；7.在25℃下培養(yǎng)直到長出側(cè)根

暗培養(yǎng)4天后長出側(cè)根，7天后又可切離側(cè)根的根尖作為新的培養(yǎng)材料再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。通過這種由單個直根衍生而來，并經(jīng)繼代培養(yǎng)而保持遺傳性一致的根的培養(yǎng)物，可稱為離體根的無性系。

二、培養(yǎng)基目前培養(yǎng)番茄離體根時，使用改良的懷特培養(yǎng)基（表6-1）。培養(yǎng)基中氮源以硝酸鹽的效果好，蔗糖是雙子葉植物離體根培養(yǎng)最好的碳源。與懷特培養(yǎng)基相比，降低了大量元素的濃度，但甘氨酸和煙酸的用量增加，硫胺素（維生素B6）對離體根培養(yǎng)的作用明顯，所用濃度仍為0.1mg/L。在這個培養(yǎng)基中增加了碘的成分，因為碘有利于番茄根的生長，濃度為0.38mg/L。硼對離體根的生長也具有重要的影響，缺硼會降低根尖細(xì)胞的分裂速度，阻礙細(xì)胞伸長等。

第二節(jié)莖的培養(yǎng)

根據(jù)取材部位莖的培養(yǎng)可分為莖尖培養(yǎng)和莖段培養(yǎng)。關(guān)于莖尖培養(yǎng)詳見第八章，這里只討論莖段的培養(yǎng)。

一、莖段培養(yǎng)過程

莖段培養(yǎng)是指帶有腋（側(cè)）芽或葉柄、長數(shù)厘米的莖節(jié)段進(jìn)行離體培養(yǎng)。

由于嫩莖段（即當(dāng)年萌發(fā)或新抽出的尚未完全木質(zhì)化的枝條），其細(xì)胞的可塑性大，容易離體培養(yǎng)，常作為外植體。一般在無菌條件下，將經(jīng)過消毒的莖段切成數(shù)厘米長帶節(jié)的節(jié)段，接種在固體培養(yǎng)基上。莖段可直接形成不定芽或先誘導(dǎo)形成愈傷組織，再脫分化形成再生苗。把再生苗進(jìn)行切割，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，便可得到完整的小植株。

現(xiàn)以月季為例說明。

（一）培養(yǎng)基誘導(dǎo)萌芽培養(yǎng)基MS+BA0.5-1.0mg/L；增殖培養(yǎng)基MS+BA1.0-2.0mg/L+NAA0.01-0.1mg/L或MS+BA1.0-2.0mg/L+IAA0.1-0.3mg/L；生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1-0.2mg/L+IAA1.0mg/L或1/2MS+IBA0.75mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖2%。

（二）培養(yǎng)過程1.取材生長健壯的當(dāng)年生枝條，取其飽滿的未萌芽的作為外植體。一般取中部的側(cè)芽誘導(dǎo)效果最好。

2.滅菌切去葉片及葉柄，切成1～2cm的帶節(jié)莖段（如果是嫩梢需切去少許芽的頂部）。將原來向下的莖端切成斜面，向上的莖端切成平面（這是為了以后接種時方便，也為了避免接種時將上下顛倒）。將清理好的材料在自來水下沖洗干凈，然后在無菌條件下用70%酒精表面消毒30s，用無菌水洗3～4次，用0.1%的升汞溶液滅菌8～12min(或用2%漂白粉溶液滅菌8～12min),取出后在無菌水中清洗4～5次（用漂白粉溶液滅菌的清洗3～4次）。3.接種、生長及分化

在無菌條件下操作，將莖段兩端用解剖刀切去少許(以除去被殺菌劑傷害的組織)，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，7d后芽開始萌發(fā)，莖尖展葉生長，20d后長至1～2cm；

4.繼代培養(yǎng)

萌生芽會不斷長大，并可從莖段上分化出若干個叢生芽，這時可通過側(cè)芽增殖和叢生芽再生的方式進(jìn)行繼代增殖，切割出叢生芽或?qū)⒂籽糠智谐擅慷魏?～2個節(jié)的莖段，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，每隔4周繼代一次。對于增殖率過高的品種，小苗會變得非常細(xì)弱，一般需要轉(zhuǎn)入MS+BA0.3MG/l+NAA0.1mg/L(或IBA0.3mg/L)的低分裂素培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。

5.生根培養(yǎng)將繼代增殖的叢生苗切成長度為2～3cm的單株，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，12d后便可生根。當(dāng)根長0.5cm，有2～4條白色的根系時即可出瓶移栽。在生根培養(yǎng)基中加入0.3g/L活性炭可提高生根質(zhì)量。

莖段→不定芽→再生苗→生根→盆栽

↓↑愈傷組織→芽分化

球莖類花卉是一類變態(tài)莖（球莖、鱗莖）的植物，其繁殖可用分球或鱗片進(jìn)行離體培養(yǎng)，達(dá)到大量增殖。球莖類通常在地下培育，污染率比較高。對百合的鱗莖消毒時，要把外面幾層的鱗片剝?nèi)?，認(rèn)真用水清洗后，再將鱗莖底部臟的部分用鋒利小刀剝?nèi)?，在超凈工作臺上用70%酒精浸半分鐘，然后在0.1%升汞溶液中浸泡10-12min，用無菌水沖洗3～4次，用消毒的濾紙吸干表面水分，切取鱗片接種于培養(yǎng)基上，通過芽的誘導(dǎo)、增殖、成球與生根，培養(yǎng)成了完整植株。

二、培養(yǎng)基誘導(dǎo)、擴(kuò)繁和生根培養(yǎng)基大量的用MS培養(yǎng)基，再加入不同濃度的不同種類的生長素和細(xì)胞分裂素。

這是百合鱗莖誘導(dǎo)的植株第三節(jié)葉的培養(yǎng)

很多植物如香葉、天竺葵、秋海棠等的葉片具有很強(qiáng)的再生能力，由于取材方便，數(shù)量多且均一性較強(qiáng)，為適宜的外植體。一、培養(yǎng)過程

葉片從枝上摘取后，用水沖洗數(shù)小時，通過表面消毒后接種于固體培養(yǎng)基上。葉片在培養(yǎng)基的生長狀況大多依賴于葉子離體時的成熟程度，一般說來，幼葉比近成熟的葉生長潛力大。很多植物的葉組織在離體培養(yǎng)條件下先形成愈傷組織，然后通過愈傷組織再分化出胚狀體、莖、葉和根（圖7-2）。圖7-2由葉組織培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織及胚狀體再生植株

如從香石竹頂芽或腋芽下面取葉片，平放在MS+1mg/LBA培養(yǎng)基上，5天后外植體開始膨大，基部略有綠色愈傷組織形成，10天后開始從基部分化出淺綠色小芽點，并逐漸長成小芽叢，經(jīng)過生根培養(yǎng)后得到完整小植株。離體葉的培養(yǎng)也可以發(fā)生不定芽結(jié)構(gòu)。

二、培養(yǎng)基

離體葉經(jīng)誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基（生長素與細(xì)胞分裂素的比值較大）的培養(yǎng)，形成愈傷組織，愈傷組織轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基（生長素與細(xì)胞分裂素比值較?。┥?，分化出不定芽。如：長壽花實生苗葉片，經(jīng)表面消毒后，切成.5cm×0.5cm的方塊，接種于MS+1mg/L2,4－D+0.1mg/LBA培養(yǎng)基上，經(jīng)過30天左右的培養(yǎng)，葉片邊緣開始出現(xiàn)淡綠色顆粒狀突起，繼續(xù)培養(yǎng)后顆粒突起逐漸擴(kuò)大，以后形成質(zhì)地致密的淡綠色愈傷組織塊。

經(jīng)繼代培養(yǎng)后，獲得大量愈傷組織。將愈傷組織切成0.5cm×0.5cm的大小，接種到培養(yǎng)基MS+1mg/LBA+0.1mg/LNAA上，15天后愈傷組織明顯轉(zhuǎn)綠和增大；50天左右開始產(chǎn)生綠色芽點并陸續(xù)分化出芽，每塊愈傷組織可分化出5～6株無根苗，在1/2MS培養(yǎng)基上，全部長出不定根。楊樹、中華獼猴桃等植物常從葉柄或葉脈的切口處形成愈傷組織。用綠巨人幼葉的葉柄，在含5mg/LBA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2個月后葉柄處形成致密綠色愈傷組織，每塊愈傷組織上可分化8～10個不定芽，當(dāng)不定芽長至0.5cm時，將不定芽同一部分愈傷組織移入到含2mg/LBA和0.2mg/LNAA的培養(yǎng)基中，不定芽迅速伸長并長成健壯小苗。大蒜貯藏葉及水仙的鱗片葉直接或經(jīng)愈傷組織再生出球狀體或小鱗而發(fā)育成再生植株。

葉離體培養(yǎng)可直接形成不定芽結(jié)構(gòu)。用綠巨人幼葉接種到MS培養(yǎng)基中，在0.2～0.5mg/LBA和0.7～2mg/L2,4－D的誘導(dǎo)下，5周后切口處出現(xiàn)綠色突起，再接種到不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基(MS+2～3mg/LBA+0.3～0.4mg/LNAA)后，3～4周形成不定芽，切割小芽繼續(xù)培養(yǎng)，每4周可增殖4～6倍。用大豆葉柄基部插入分化培養(yǎng)基（1/2MS+1mg/LBAP）上誘導(dǎo)，2周后從葉柄基部長出小芽和叢芽，誘導(dǎo)率達(dá)60%～70%。

第四節(jié)原球莖培養(yǎng)

在蘭科植物組培中,常從莖尖、側(cè)芽或種子培養(yǎng)中產(chǎn)生原球莖（前者可看成器官培養(yǎng)，后者可看成胚培養(yǎng)），原球莖可以增殖萌發(fā)出小植株。

一、以莖尖培養(yǎng)來誘導(dǎo)原球莖

（一）取材及滅菌從生長的植株上切取5-15cm的新芽，去掉苞葉，用流水沖洗干凈，放入70%酒精中浸泡數(shù)秒鐘，用無菌水沖洗后，在加有幾滴吐溫-20的飽和漂白粉上清液中浸10min左右，然后用無菌水沖洗2-3次，置消毒濾紙中吸干水分備用。（二）莖生長點的剝?nèi)?/p>

在超凈工作臺上，將經(jīng)過滅菌的備接材料置于雙筒解剖鏡下，用解剖工具將外表的幼葉剝掉，露出帶少數(shù)葉原基的生長點后，用小刀切取芽。（三）原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)蘭花的莖尖可采用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，如B5,White,MS,1/2MS等，不用2，4-D。常用0.1-0.5mg/L