溶血性貧血實驗室檢查2012-3-262課件

根據(jù)病因和發(fā)病機制的貧血分類一、紅細胞生成不足

（一）造血干細胞復制和分化異常再生障礙性貧血異常細胞或組織骨髓浸潤骨髓病性貧血原因不明或多種機制慢性系統(tǒng)性疾?。愿腥?、炎癥、惡性腫瘤、慢性腎病、肝病、風濕性疾病、內(nèi)分泌病等）伴發(fā)的貧血

（二）細胞分化和成熟障礙

DNA合成障礙葉酸及（或）維生素B12缺乏所致巨幼細胞貧血血紅蛋白合成障礙缺鐵性貧血、鐵粒幼細胞性貧血珠蛋白合成缺陷珠蛋白生成障礙性貧血（海洋貧）

二、紅細胞破壞過多

紅細胞內(nèi)在缺陷（遺傳性缺陷）紅細胞外來因素（獲得性因素）

三、失血

急性失血急性失血后貧血慢性失血同缺鐵性貧血溶血性貧血

的實驗室檢查什么叫溶血性貧血？hemolyticanemia----指各種原因?qū)е录t細胞生存時間縮短、破壞增多或加速，骨髓代償造血功能不足時所發(fā)生的一類貧血。什么叫溶血性疾病？指骨髓代償能力尚足以補償紅細胞的損耗而不出現(xiàn)貧血。溶血性貧血的分類(病因和發(fā)病機制)1、RBC內(nèi)在缺陷所致的溶貧（1）

RBC膜缺陷：遺傳球PNH（2）

HB結構異常：海洋性貧血（3）RBC內(nèi)酶缺陷：G-6PD缺乏癥2、RBC外來因素所致的溶貧AIHA、藥物、化學因素、感染因素溶血性貧血的分類（溶血的場所）1、血管內(nèi)溶血：RBC在循環(huán)血液中直接破壞，如血型不合輸血PNH2、血管外溶血：RBC在脾臟破壞，如球形RBC增多癥、脾亢3、原位溶血：幼RBC在骨髓中溶血，如AL、巨幼貧如何診斷溶血性貧血？第一步確定是否有溶血第二步哪一類溶貧溶血性貧血篩查紅細胞壽命測定方法：51Cr標記紅細胞，檢測其半衰期正常紅細胞半衰期25—32天溶血性貧血者半衰期小于15天確定溶血性貧血的可靠方法溶血性貧血篩查血漿游離血紅蛋白測定參考值：＜50mg/L(1-5mg/dl)臨床意義：血管內(nèi)溶血者明顯升高AIHA、珠蛋白生成障礙性貧血者輕度升高血管外溶血時正常溶血性貧血篩查血清結合珠蛋白測定參考值：0.7-1.5g/L臨床意義：各種溶血均可減低，血管內(nèi)溶血減低最顯著肝病、傳單、先天性無結合珠蛋白血癥減少或消失感染、創(chuàng)傷、糖皮質(zhì)激素治療、服用避孕藥物、肝外阻塞性黃疸可增高溶血性貧血篩查血漿高鐵血紅素清蛋白測定方法：生化法：與硫化銨形成銨血色原，經(jīng)光譜儀測定558nm吸收光帶電泳法：醋酸纖維膜電泳正常值：陰性臨床意義：陽性者表示嚴重的血管內(nèi)溶血溶血性貧血篩查含鐵血黃素尿試驗（Rous試驗）原理：鐵離子+氰化鉀鐵氰化鐵（藍色）如腎小管上皮有含鐵血黃素，該試驗陽性正常值：陰性臨床意義：陽性者表示慢性血管內(nèi)溶血，如PNH含鐵血黃素（二）顯示紅細胞代償增生依據(jù)外周血網(wǎng)織紅增多；外周血紅細胞形態(tài)：

大小不均，大紅細胞、嗜多色細胞及有核紅細胞，Howell-Jolly小體、Cabot環(huán)、點彩紅細胞等增生性貧血骨髓象：

增生明顯活躍，紅系顯著增生，粒系相對減少，巨核系一般正常

二、哪一類溶血性貧血？（一）紅細胞膜缺陷的檢驗

紅細胞滲透脆性試驗紅細胞孵育滲透脆性試驗自身溶血試驗及糾正試驗1、

紅細胞滲透脆性試驗原理:正常紅細胞為雙凹圓盤狀,在低滲鹽水中吸水膨脹的適應性較大(可增加70%的體積而不破裂)遺傳性球形細胞增多癥等紅細胞的表面積/體積(S/V)的比值小,對低滲鹽水的適應性小(脆性增大)本試驗是測定紅細胞在一系列不同濃度低滲氯化鈉鹽水內(nèi)開始溶血和完全溶血的氯化鈉濃度，檢測其對不同濃度的低滲鹽水溶血的抵抗力。

紅細胞滲透脆性試驗

（erythrocyteosmoticfragilitytest)

原理：低滲溶液紅細胞皺縮紅細胞膨脹甚至破裂高滲溶液等滲溶液正常低滲溶液

參考值

0.6-0.8%NaCl溶液——紅細胞不破裂0.42-0.46%NaCl溶液——部分紅細胞破裂0.28-0.34%NaCl溶液——紅細胞完全破裂NaCl0.85%0.6%0.42%0.34%0.8%0.7%對低滲溶液抵抗能力減小即RBC滲透脆性增加臨床意義

（1）脆性增高

開始溶血及完全溶血時氯化鈉濃度較正常對照提前兩管，即0.04%以上;開始溶血＞0.5%，完全溶血＞0.38%主要見于遺傳性球形紅細胞增多癥（2）脆性減低

小細胞低色素性貧血：海洋性貧血、缺鐵性貧血2、紅細胞孵育滲透脆性試驗

原理

37℃孵育24小時，細胞內(nèi)葡萄糖消耗增加，ATP減少，鈉離子泵出減少，細胞膨脹，脆性增高。

參考值

未孵育50%溶血4~4.45g/LNaCl孵育50%溶血4.65~5.9g/LNaCL

臨床意義——常用于輕型遺傳球、遺傳性非球形細胞溶血的診斷

脆性增高遺傳性球形紅細胞增多癥脆性減低缺鐵性貧血、珠蛋白生成障礙性貧血、鐮形細胞貧血、脾切除術后3、自身溶血試驗及糾正試驗

原理

先天性非球形紅細胞溶血患者紅細胞內(nèi)酶缺陷，葡萄糖酵解障礙，ATP不足不能維持細胞鈉泵作用患者紅細胞在自身血漿中孵育48h，溶血增強，可加入葡萄糖、ATP，觀察溶血能否被糾正

參考值

正常人孵育后輕微溶血、溶血度＜3.5%加葡萄糖和加ATP后，溶血明顯糾正，溶血度＜1%3、自身溶血試驗及糾正試驗

臨床意義——常用于遺傳球、遺傳性非球形細胞溶血的鑒別診斷

遺傳性球形細胞增多癥遺傳性非球形細胞性溶貧（Ⅰ型）葡萄糖6磷酸脫氫酶缺陷癥（Ⅱ型）丙酮酸激酶缺陷癥孵育后溶血增強增強增強加葡萄糖后溶血明顯糾正部分糾正不能糾正加ATP后溶血明顯糾正部分糾正糾正（二）紅細胞酶缺陷的檢驗

定義：紅細胞酶缺陷所致溶血性貧血又稱紅細胞酶病，指參與紅細胞代謝的酶由于基因缺陷，導致活性改變而發(fā)生溶血的一組疾病內(nèi)容：高鐵血紅蛋白還原試驗氰化物-抗壞血酸試驗變性珠蛋白小體生成試驗葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點試驗和活性測定丙酮酸激酶熒光篩選試驗和活性測定原理1、高鐵血紅蛋白還原試驗G6PD正常NADPH還原型輔酶Ⅱ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸高鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白NADPH充足G6PD高鐵Hb還原酶G6PG6-PANADPNADPH還原型美蘭氧化型美蘭高鐵Hb（Fe3+）為褐色氧合HB（Fe2+）紅色結果：光電比色法，正常還原率＞75%，低于75%為異常，提示G6PD活力↓，74～31%為G-6PD缺乏的雜合子（紅棕色），30%以下為顯著缺陷的純合子（為棕色—目測比色法）。參考值高鐵血紅蛋白還原率＞75%高鐵血紅蛋白0.3~1.3g/L臨床意義G6PD缺陷導致高鐵血紅蛋白還原率下降見于蠶豆病、伯氨喹型藥物溶血性貧血1、高鐵血紅蛋白還原試驗原理:6-磷酸葡萄糖

NADP

GSH

H202

氧合血紅蛋白

6-磷酸葡萄糖酸

NADPH

GSSG

H20

高鐵血紅蛋白結果:正常人標本呈紅色G-6PD2、氰化物-抗壞血酸試驗臨床意義:正常血液數(shù)小時后變成暗色純合子G6PD缺乏者2h變色雜合子G6PD缺乏者3~4h變色3、變性珠蛋白小體生成試驗又稱“紅細胞包涵體”、“赫恩小體”、“Heinz小體”、“海因小體”原理：G-6PD缺乏致紅細胞內(nèi)GSH減少，高鐵血紅蛋白增高，形成變性珠蛋白小體，沉著于紅細胞膜上。

抗凝血+乙酰苯肼37℃溫育2～4h充分的氧化 其Hb氧化成Heinz小體（用結晶紫、甲紫或煌焦油蘭染色，油鏡觀察）1.正常人＜30%2.G6PD缺陷癥、不穩(wěn)定Hb、HbH病等常高于45%結果：

該小體為圓形或多角形色涵體，φ0.2～2um。多位于紅細胞邊緣，一個紅細胞含1～20個，多為1～2個，以含5個以上小體的紅細胞計數(shù)4、G6PD熒光斑點試驗和活性測定原理:

G6PD使NADP還原成NADPH,后者在紫外線照射下發(fā)出熒光

參考值：正常人強熒光；酶活性5U/gHb

6-磷酸葡萄糖NADPGSHH202氧合血紅蛋白

6-磷酸葡萄糖酸NADPHGSSGH20高鐵血紅蛋白G-6PD5、丙酮酸激酶熒光篩選試驗和活性測定原理:

ADP+PK磷酸丙酮酸

丙酮酸NAPH

乳酸NAD（無熒光）參考值正常PK活性熒光在20min內(nèi)消失酶活性15.1±4.99U/gHb臨床意義PK嚴重缺乏（純合子）熒光60min不消失雜合子熒光25~60min消失(三)、珠蛋白合成異常的檢測血紅蛋白的結構

原卟啉

血紅素Hb（四聚體）鐵

2條α鏈

珠蛋白：由4條多肽鏈組成

2條非α鏈正常人HbA（22）97%HbA2（22）1.5-3%HbF（22）0.5-0.8%

血紅蛋白病珠蛋白肽鏈量的不正常(地中海貧血)血紅蛋白分子結構異常(異常血紅蛋白病)遺傳性溶血性疾病

1.血紅蛋白電泳蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)—是由氨基酸的NH+與COO-決定的。等電點—調(diào)節(jié)水溶液的pH，能使蛋白質(zhì)的NH+與COO-數(shù)目相等呈電中性，此時蛋白質(zhì)無電泳，在水中電解度小，并發(fā)生沉淀。

電泳：一個帶電荷的離子或膠體顆粒在電場中可向一極移動。

原理：在一定的pH緩沖液中，緩沖液的pH大于Hb等電點，其帶負電，在電場中向陽極移動；反之向陰極移動。由于各種Hb珠蛋白肽鏈結構不同，其等電點不同，電泳方向和速度亦不同，故可分離出不同的區(qū)帶，對區(qū)帶進行電泳掃描，可進行Hb定量分析。(+)HJKAGDE(-)

1.HbH增多是HbH病，為α-地中海貧血的一種；HbA2明顯增高見于輕型β地中海貧血；HbF明顯增高見于中重型β地中海貧血。2.正常值：醋纖法（PH8.6）HbA96%~98%，HbA21.0%~3.1%，HbF＜2%電泳結果CAA2FA異常正常2.胎兒蛋白HbF（22）酸洗脫試驗：含HbF紅細胞著色原理：HbF抗酸力強臨床意義：臍帶血、新生兒、嬰兒陽性成人小于1%地中海貧血輕者少數(shù)紅細胞陽性地中海貧血重癥陽性細胞增多

3.HbF定量測定（堿變性試驗）:

原理：堿性溶液中HbF不易變性沉淀，可測定濾液中Hb量臨床意義：2歲-成人HbF<2%，>4%為異常重型地貧80-90%AL、AA、淋巴瘤等可輕度升高

4.HbA2定量測定

診斷輕型地貧的重要依據(jù)5.限制性內(nèi)切酶譜分析基因診斷(四)、自身免疫性溶血性貧血檢測自身免疫性溶血性貧血

（autoimmunehemolyticanemia,AIHA)定義：體內(nèi)免疫異常，產(chǎn)生自身抗體、補體，結合在紅細胞膜上使紅細胞破壞加速病因：尚未完全闡明，可能因素：病毒感染可激活多克隆B細胞或化學物與紅細胞膜相結合，改變其抗原性，導致自身抗體產(chǎn)生分類：

可為原發(fā)性的，也可繼發(fā)于結締組織病、造血系統(tǒng)腫瘤、感染等按抗體反應最適溫度分為溫抗體型和冷抗體型，后者又分為冷凝集素綜合征和陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿1.Coombs試驗（抗人球蛋白試驗）

原理：不完全抗體(IgG)，無法架接兩個鄰近的紅細胞，而只能和一個紅細胞抗原相結合?？谷饲虻鞍卓贵w是完全抗體,可與多個不完全抗體的Fc段相結合,導致紅細胞凝集現(xiàn)象,稱為抗人球蛋白試驗陽性。

目的：檢查紅細胞表面的或血清中游離的不完全抗體，用于診斷AIHA。直接CoombsTest(+)說明病人RBC表面上包被有不完全抗體間接CoombsTest(+)則說明病人血清中存在著不完全抗體Coombs血清（抗人球蛋白血清）（1）直接試驗１．正常人：陰性２．直接反應陽性，最常見于AIHA（其他有藥物誘發(fā)的溶貧、陣發(fā)性冷性Hb尿、新生兒同種免疫溶血病、SLE、類風濕關節(jié)炎、惡性淋巴瘤等）。目的：測定吸附于紅細胞表面的不完全抗體方法：結果：（2）間接試驗有過?？贵w時直接、間接均為陽性。AIHA分三型：C3型12%，IgG型24%，IgG+C3型60%。冷凝集素病為IgM抗體。目的：測定血清中游離的不完全抗體方法：結果：間接陽性，見于AIHA，正常人為陰性。病人血清正常RBC抗IgG2.冷凝集素試驗原理冷凝激素是可逆性抗體：低溫時可與自身紅細胞、O型紅細胞、患者同型紅細胞發(fā)生凝集，溫度升高時，凝集塊又復消失參考值效價低于1:40，反應最高溫度4℃臨床意義某些AIHA很高3.冷熱雙相溶血試驗原理：陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿癥（PCH）患者的血清中有雙相溶血素，在0-4C時，溶血素與紅細胞結合，并吸附補體，但不溶血