-植物DNA分子標(biāo)記課件

植物DNA分子標(biāo)記

分子標(biāo)記的概念廣義的分子標(biāo)記（molecularmarker）：可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白。包括蛋白質(zhì)標(biāo)記和DNA標(biāo)記（狹義的分子標(biāo)記）。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括動(dòng)植物蛋白、同工酶及等位酶理想的分子標(biāo)記：

1.高多態(tài)性2.共顯性遺傳*

3.能明確辨別等位基因4.遍布整個(gè)基因組

5.無(wú)基因多效性**6.檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快速

7.成本低廉8.重復(fù)性好*雜合子的一對(duì)等位基因各自都具有自己的表型效應(yīng)，稱為共顯性（codominance）**基因多效性（genepleiotropism）：一個(gè)基因產(chǎn)生多種表型效應(yīng)的現(xiàn)象。

DNA分子標(biāo)記（DNAmolecularmarker）直接在DNA分子水平上檢測(cè)生物間的差異，是DNA水平上遺傳變異的直接反應(yīng)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。DNA分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，分為非PCR依賴的分子標(biāo)記(基于Southern雜交技術(shù)的分子標(biāo)記)和PCR依賴的分子標(biāo)記。非PCR依賴的分子標(biāo)記(基于Southern雜交技術(shù)的分子標(biāo)記)包括：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）原位雜交（insituhybridization）PCR依賴的分子標(biāo)記：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記

（randomamplificationpolymorphismDNA,RAPD）DNA擴(kuò)增指紋印記（DNAamplificationfingerprinting,DAF）簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（simplesequencerepeat,SSR）隨機(jī)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（arbitrarilyprimedPCR,AP-PCR）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記

（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）InsituhybridizationForinsituhybridization,atissuesampleisincubatedwithalabelednucleicacidprobe,excessprobeiswashedawayandthelocationofhybridizedprobeisexamined.Thetechniqueenablesthespatiallocalizationofgeneexpressiontobedeterminedaswellasthelocationofindividualgenesonchromosomes.bcdaFig.5GISHimagesofchromosomesoftetraploidanddiploidFestuloliumprogenies.TheDNAofL.perennewasusedasprobe,andshownasbluecolor.ThechromosomesofF.pratensiswereshownaspalebluecolor.Translocationbreakpointsareindicatedinaandcbyarrows.(a)Bx350-184,a28-chromosomegenomewithatleast14intergenerictranslocations,someofwhichhavetwobreakpointsinanarm(arrows).Bar:10μm.(b)Bx351-160,a28-chromosomegenomewithintergenerictranslocations.Bar:20μm.(c)Bx350-177withfertilepollen,a28-chromosomegenomecomprisingapproximatelyequalamountofLoliumandFestucaDNAwith9intergenerictranslocations,someofwhichhavetwobreakpointsinanarm(arrows).Bar:20μm.(d)Prior-57,a14-chromosomegenomewithintergenerictranslocations.Bar:10μm.Guoetal.2005RFLP標(biāo)記：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLP指應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切酶切割有關(guān)的DNA分子所產(chǎn)生的DNA片段在長(zhǎng)度上的變化。包括基因組DNA限制性酶切，Southern印記，DNA探針制備，同位素/非同位素標(biāo)記，DNA分子雜交等步驟。

生物能快速、精確地復(fù)制自身的DNA，但這種精確性是相對(duì)的。實(shí)際上，在植物的自然群體中存在大量的DNA序列變異。如：堿基對(duì)的代換、缺失等。幾乎不可能有兩個(gè)生物體DNA的堿基序列是相同的。限制性內(nèi)切酶酶解DNA長(zhǎng)鏈，是識(shí)別DNA上的特異的位點(diǎn)并在這些位點(diǎn)上切斷的過(guò)程。酶識(shí)別位點(diǎn)堿基對(duì)越少，DNA分子中被識(shí)別的位點(diǎn)越多，所產(chǎn)生的限制片段越短。

來(lái)自一個(gè)完整的純合子的個(gè)體的每一種同源DNA分子，都會(huì)在同樣的位點(diǎn)被準(zhǔn)確切割。但是在不同物種、不同品種、甚至同一品種的不同的兩個(gè)個(gè)體之間，DNA會(huì)發(fā)生變異，其中有些變異導(dǎo)致了限制性酶切位點(diǎn)的更動(dòng)，從而產(chǎn)生了限制片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。

用限制性酶來(lái)酶解植物核DNA會(huì)產(chǎn)生數(shù)萬(wàn)個(gè)片段，其大小變化是連續(xù)的，如進(jìn)行電泳分離，只能看到彌散狀的連成一片的電泳結(jié)果。然而，各限制片段在凝膠中還是分開(kāi)的，但不能分辨。進(jìn)行Southern印跡轉(zhuǎn)移操作，用特定的探針與濾膜上的DNA雜交，經(jīng)過(guò)放射自顯影就能檢測(cè)到高等植物核DNA的RFLP。0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb(1)0.3kb0.4kb0.5kb×(2)0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系20.4kb0.1kb+–RFLP標(biāo)記方法與步驟（1）DNA的分離：可用CTAB法或SDS法（2）酶切：一般根據(jù)基因組總DNA的復(fù)雜性選 用限制酶。（3）瓊脂糖凝膠電泳（4）Southern印跡轉(zhuǎn)移（5）DNA雜交及放射自顯影RFLP標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)

（1）不受性別、年齡局限，不會(huì)受表達(dá)的組 織、發(fā)育階段或外界環(huán)境的不同而受影（2）標(biāo)記座位的等位基因間是共顯性的，通過(guò) 雜交后電泳帶型可直接區(qū)別雜合子和顯性 純合子（3）RFLP標(biāo)記源于基因組DNA自身變異，在 數(shù)量上幾乎不受限制。RFLP標(biāo)記缺點(diǎn)

（1）DNA需要量大。（2）所需儀器較多（3）技術(shù)較為復(fù)雜（4）多數(shù)RFLP表現(xiàn)為二態(tài)性，提供的信息量較低（5）與內(nèi)切酶選用密切相關(guān)RAPD標(biāo)記1990年，美國(guó)杜邦公司科學(xué)家Williams推出。RAPD方法是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它利用一系列單個(gè)隨機(jī)引物（通常為10個(gè)核苷酸），對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物與基因組DNA某一區(qū)段互補(bǔ)時(shí)，就與其結(jié)合，就可對(duì)引物下游DNA進(jìn)行合成，即擴(kuò)增。RAPD的基本概念和原理RAPD的引物：

（1）為隨機(jī)引物（2）序列較短（通常為10個(gè)核苷酸）（3）為一個(gè)寡核苷酸單鏈引物0.2kb0.5kb0.3kb0.2kb0.5kb0.3kb×0.2kb0.3kb0.5kb品系1品系2RAPD的基本實(shí)驗(yàn)程序1.DNA的提取2.模板DNA濃度和質(zhì)量的檢測(cè)3.PCR擴(kuò)增4.電泳檢測(cè)：PCR結(jié)束后每個(gè)樣品加4ul凝膠上樣緩沖液，每個(gè)泳道點(diǎn)樣20ul。5.將凝膠浸于1ug/ml的EB中30min~60min，用水清洗約10min，觀察、拍照。6.統(tǒng)計(jì)分析：記錄條帶清晰的RAPD條帶，計(jì)算帶紋相似率；計(jì)算帶頻率、群內(nèi)遺傳純度；DNA片段大小。

RAPD結(jié)果Timothygeneticvariation(Guoetal.2002)RAPD的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物不需知道序列信息。覆蓋整個(gè)基因組。具有廣泛適用性和通用性。（2）用一個(gè)引物可擴(kuò)增出多片段。（3）技術(shù)簡(jiǎn)單，需要樣品量少，成本低。（4）每個(gè)RAPD標(biāo)記相當(dāng)于基因組分析中的靶序列位點(diǎn)，簡(jiǎn)化信息的轉(zhuǎn)移過(guò)程。（5）可以對(duì)RFLP難以分析的基因組區(qū)域做遺傳連鎖圖。（6）分析自動(dòng)化。RAPD的優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)：（1）顯性標(biāo)記，無(wú)法區(qū)別顯性純合體和雜合體。（2）對(duì)反應(yīng)條件敏感，重復(fù)性差。模板濃度、 Mg2+濃度，PCR反應(yīng)中條件的變化等。（3）存在共遷移問(wèn)題。不同個(gè)體相同分子量的片段不一定同源；一條帶可能包含不同的產(chǎn)物。AFLP標(biāo)記AFLP：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）AFLP技術(shù)是1992年由荷蘭Keygene公司的科學(xué)家ZabeauMare和VosPieter發(fā)明并發(fā)展起來(lái)的一種選擇擴(kuò)增限制酶切片段的方法。

AFLP的基本原理植物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化形成相對(duì)分子量大小不等的隨機(jī)限制性酶切片段，隨后將特定的接頭連接在這些DNA片段兩端，接頭序列和鄰近限制性酶切位點(diǎn)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過(guò)PAGE分離擴(kuò)增的特異限制性片段。在不需要DNA序列的情況下，利用一套特定引物可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量的片段。

AFLP的基本原理AFLP引物是一種人工合成的單鏈寡核苷酸，一般長(zhǎng)度為18~20個(gè)核苷酸。引物主要由3部分組成：（1）核心序列（CORE），該序列與人工接頭互補(bǔ)；（2）限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異序列（ENZ）；（3）選擇性延伸序列（EXT），即引物3端的選擇堿 基，選擇堿基延伸到酶切片段區(qū)。如：EcoRI引物和MseI引物EcoRI5′-GACTGCGTACCAATTCNNN-3′MseI5′-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3′COREENZEXTAFLP的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）少量引物可獲得較多標(biāo)記，50~150條帶（2）多為顯性標(biāo)記或共顯性標(biāo)記，受環(huán)境影響小，無(wú)復(fù)等位效應(yīng)（3）帶型清晰，具高分別率（4）由于用兩種引物經(jīng)兩步選擇擴(kuò)增，帶型穩(wěn)定，帶紋豐富，靈敏度高，重復(fù)性好（5）不需事先知道DNA序列信息缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)用較高SSR標(biāo)記SSR：簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeat）多態(tài)性，也叫微衛(wèi)星標(biāo)記。微衛(wèi)星：即短串聯(lián)重復(fù)(Short

Tandem

Repeat，STR)，它是由2-6bp重復(fù)單位構(gòu)成的DNA序列，通常多態(tài)性片段長(zhǎng)度在100-300bp。以人類基因組為例，平均每15-20kb就存在1個(gè)STR座位，據(jù)此估計(jì)整個(gè)人類基因組中大約有50,000-100,000個(gè)STR位點(diǎn)。由于微衛(wèi)星DNA具有高度的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，所以非常適合作為遺傳學(xué)DNA分子標(biāo)記。

真核生物基因組中散布著大量的微衛(wèi)星DNA，微衛(wèi)星DNA由更短的重復(fù)單位串聯(lián)而成，重復(fù)長(zhǎng)度一般為2~6bp，一個(gè)SSR總長(zhǎng)度可達(dá)幾十到幾百bp。許多微衛(wèi)星間的不等交換或復(fù)制過(guò)程中的DNA滑動(dòng)而高度可變，因而顯示出了豐富的限制性片段多態(tài)性。正因?yàn)檎婧松镏懈缓?jiǎn)單重復(fù)序列，而重復(fù)序列兩端往往是相對(duì)保守的限制酶位點(diǎn)，所以通過(guò)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳和放射自顯影，就可檢測(cè)到簡(jiǎn)單重復(fù)序列單位數(shù)不同的DNA區(qū)域多態(tài)性。Bx351-241(2n)Bx351-229(2n)Bx351-200(2n)Bx351-231(2n)Bx351-217(2n)Bx351-238(2n)Bx351-175(4n)Bx351-214(4n)Bx351-185(4n)Bx351-184(4n)Bx351-267(4n)Bx351(wt,4n)D-12(parentalline)Tomosakae(parentalline)NC105150250bpFig.6SSRprofilesofFestuloliumprogenieswithprimerLPSSRK10F08showedamplifiedpolymorphismamongthediploidandtetraploidFestuloliumprogeniesandshowedtwotetraploid-specificbandof110bpand115bp(arrows)whichalsoappearedintheamphidiploidFestuloliumwildtypeplant(2n=4x=28)andputativeparentalD-12(Loliumperenne)plant,respectively.NC,negativecontrol.RFLPRAPDAFLPSSRSNP遺傳特性共顯性顯性顯性/共顯性顯性顯性/共顯性多態(tài)性低中等高高低檢測(cè)基礎(chǔ)分子雜交隨機(jī)RCP專一PCR專一PCR專一PCR檢測(cè)基因組部位單/低拷貝整個(gè)基因組整個(gè)基因組重復(fù)序列區(qū)整個(gè)基因組技術(shù)難度難易易易易DNA質(zhì)量高低低低低