質(zhì)粒的提取和電泳課件

觀察昨天實(shí)驗(yàn)課的結(jié)果1、觀察自己組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)化平板*培養(yǎng)板在37C培養(yǎng)12-16h衛(wèi)星菌：培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)2、實(shí)驗(yàn)中的難點(diǎn)*制備效率高的感受態(tài)細(xì)胞重組質(zhì)粒的鑒定平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含有空質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的細(xì)胞提取的質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定如何鑒定平板上的菌落為含有重組質(zhì)粒的菌落？平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含有空質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的細(xì)胞提取的質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定小量制備質(zhì)粒和電泳分析質(zhì)?！|(zhì)粒載體是存在于細(xì)菌染色體外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，在宿主細(xì)胞內(nèi)可獨(dú)立自主復(fù)制并賦予宿主細(xì)胞一定的遺傳性狀篩選標(biāo)記MCS（多克隆位點(diǎn)）復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒1)培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；2)收集裂解細(xì)菌；3)分離純化質(zhì)粒DNA。

質(zhì)粒提取原理：質(zhì)粒提取有多種方法，但都包含有3個(gè)基本步驟：√去除蛋白質(zhì)√去除基因組DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？堿裂解法提取質(zhì)粒的原理原理：1、強(qiáng)堿和SDS裂解細(xì)菌，細(xì)菌中的質(zhì)粒或基因組DNA在堿性條件下發(fā)生變性。2、怎樣去除基因組DNA？當(dāng)加入酸性物質(zhì)進(jìn)行中和時(shí)，質(zhì)粒DNA很快復(fù)性，

染色體DNA則和變性蛋白質(zhì)等纏繞在一起難以復(fù)性而形成沉淀，經(jīng)離心隨細(xì)胞碎片一起去除；3、怎樣去除蛋白質(zhì)？（已經(jīng)學(xué)過(guò)）留有質(zhì)粒DNA的上清，經(jīng)酚和氯仿去除蛋白質(zhì)后,用乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，即得到質(zhì)粒DNA.1)細(xì)胞懸浮液（溶液I）--懸浮菌體50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)細(xì)菌裂解液（溶液II）--裂解菌體0.2mol/L

NaOH1%SDS堿裂解法提取質(zhì)粒試劑：3）中和液（溶液III）----中和NaOH60ml5mol/L醋酸鉀11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase----降解細(xì)菌RNA工作濃度30～50

g/ml其他試劑作用和成分同實(shí)驗(yàn)一。質(zhì)粒DNA的制備（1）（細(xì)菌的收獲：）

取1.5ml工程菌液6,000轉(zhuǎn)/分，離心2min，棄上清。（2）（細(xì)菌的裂解：）

加入200

l預(yù)冷的細(xì)胞懸浮液（溶液I）懸浮細(xì)菌加入200

l細(xì)菌裂解液（溶液II），顛倒混合離心管內(nèi)容物，待溶液變粘稠為止。注：粘稠：開(kāi)蓋后出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，證明DNA已經(jīng)游出。（3）（中和：）加入150

l中和液，上下顛倒混合后置冰上5min，12,000轉(zhuǎn)/分，4℃離心5min。

堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟（去除蛋白質(zhì)）

（4）將上清移至另一離心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等體積的TE飽和的酚/氯仿/異戊醇(25：24:1)混和液，振蕩混勻1min，12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。（5）將上層水相移至另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)溶液，振蕩混勻1min，12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。（沉淀DNA）（6）將上層水相移至另一離心管中，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，置-20℃沉淀10－15min。上午實(shí)驗(yàn)結(jié)束（7）12,000轉(zhuǎn)/分離心5min。

棄上清，室溫干燥質(zhì)粒DNA5-10min。（去除RNA）（8）用20

l含RNase的水溶解質(zhì)粒DNA，輕輕吹打混合。37℃保溫10min20

l質(zhì)粒DNA溶液取出10

l放于另一個(gè)離心管中備用剩余10

l用于下一步酶切重組質(zhì)粒的鑒定平板篩選：大多數(shù)情況下，平板篩選只能區(qū)分含有或未含有質(zhì)粒的細(xì)胞，卻無(wú)法區(qū)分含有空質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的細(xì)胞提取的質(zhì)粒質(zhì)粒電泳篩選重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒的進(jìn)一步酶切鑒定質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒DNA的3種形式泳動(dòng)速度:超螺旋>線性>開(kāi)環(huán)

質(zhì)粒DNA的存在形式有3種:1、共價(jià)閉環(huán)DNA:常以超螺旋形式存在2、開(kāi)環(huán)DNA:質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子

3、線性DNA:因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.開(kāi)環(huán)超螺旋線性一、重組質(zhì)粒的酶切在一微量離心管中加入：1.重組質(zhì)粒DNA10ul2.10XBufferM2ul3.EcoRI0.5ul4.HindⅢ0.5ul5.去離子水6ul總體積20ul置37℃，45min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒的酶切結(jié)果取10ul酶切后的質(zhì)粒加2~3ul電泳上樣液，混勻。加入點(diǎn)樣孔電泳：100伏，40分鐘。注：可將5ul未切的質(zhì)粒作為對(duì)照。質(zhì)粒電泳空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒分子量變大而在電泳中滯后質(zhì)粒酶切電泳a:酶切前b:酶切后插入片段注：觀察質(zhì)粒的電泳帶型分析質(zhì)粒切不開(kāi)的原因。4.ＰCR產(chǎn)物與T載體連接3.RT-PCR5.

轉(zhuǎn)化2.提取RNA、電泳實(shí)驗(yàn)課總結(jié)------基因克隆總結(jié)1.

基因組DNA提取、酶切、電泳（1）基因組DNA提取、酶切、電泳建立基因組文庫(kù)的第一步人類基因組測(cè)序的第一步Southernblot的第一步Smear123

（2）RNA的提取、電泳28S18SRT-PCR的第一步，也是目的基因獲得的第一步；Northernblot的第一步；注意：RNA提取過(guò)程中主要避免RNA酶的污染。（3）

PCR及電泳分析1)獲得目的基因的最常用方法；2)可以進(jìn)行探針標(biāo)記；3)可以進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變4)PCR酶切片段長(zhǎng)度分析（PCR-RFLP）；5)可以定量分析基因含量（realtimePCR）.注