第01章核酸課件

第1章核酸的結(jié)構(gòu)和功能核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。第一節(jié)核酸的概念核酸(nucleicacid)

的概念1、功能---核酸是生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，決定生物的生長(zhǎng)、繁殖以及生命的代謝模式。2、結(jié)構(gòu)----是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。3、DNA儲(chǔ)存信息；RNA傳遞并表達(dá)信息4、DNA-----RNA-----蛋白質(zhì)一、核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展1868年FridrichMiescher從膿細(xì)胞中提取含磷豐富的酸性物質(zhì)---“核素”

1944年Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)20世紀(jì)50年代初，ErwinChargaff在測(cè)定多種生物的DNA組成后，發(fā)現(xiàn)A=T,G=C,這稱為“Chargaff定則”1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1968年Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1975年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA測(cè)序方法1985年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)1990年美國(guó)啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃(HGP)

1994年中國(guó)人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)1998年，國(guó)際水稻基因組計(jì)劃，2000年5月，中國(guó)超級(jí)雜交水稻基因組計(jì)劃

2001年美、英等國(guó)完成人類基因組計(jì)劃基本框架，2003年完成精細(xì)圖譜二、核酸的分類及分布98%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。包括mRNA、tRNA和rRNA分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的基因型(genotype)。參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。第二節(jié)核酸的組成成分嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥(niǎo)嘌呤(guanine,G)二、堿基嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)

核酸中也存在一些不常見(jiàn)的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。核苷：AR,GR,UR,CR脫氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR三、核苷(ribonucleoside)的形成堿基＋戊糖＝核苷連接部位：戊糖---1，堿基---9/1

連接方式：C---N糖苷鍵1′1核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

四、核苷酸(ribonucleotide)核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

體內(nèi)重要的游離核苷酸及其衍生物輔酶和輔基－含核苷酸的生物活性物質(zhì)：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有AMP能量載體----ATP、GTP食品工業(yè)上用作添加劑

單體－多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP

第二信使－環(huán)化核苷酸:cAMP，cGMPAMPcAMP5′端3′端3.核苷酸的連接上一個(gè)核苷酸戊糖３，位的羥基與下一個(gè)核苷酸戊糖５，位的磷酸以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即以３，－５，磷酸二酯鍵連接。CGA一、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)5′端3′端CGA第三節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羥基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′，一般默認(rèn)為從左到右為5’-3’。多聚核苷酸的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′

或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′

ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOHDNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的意義DNA雖然只是由于四個(gè)堿基的變化形成的四種核苷酸按照一定的順序排列起來(lái)，但值得注意的是，DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)-雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景和歷史意義DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝DNA的功能二、核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)（一）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景

堿基組成分析Chargaff

規(guī)則：[A]=

[T][G]

[C]

堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對(duì)較合理DNA纖維的X-線衍射圖譜分析（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（Watson,Crick,1953）兩條DNA單鏈分子反向平行環(huán)繞，右手螺旋走向，表面大溝與小溝相間。螺旋直徑為2nm，

主鏈：戊糖－磷酸骨架位于外側(cè)側(cè)鏈：堿基對(duì)位于內(nèi)側(cè)堿基平面垂直于螺旋軸堿基距：0.34nm；

螺距：3.4nm；周長(zhǎng)：10對(duì)堿基。（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)

（Watson,Crick,1953）堿基形成氫鍵配對(duì)，配對(duì)形式為：A=T;G

C）。堿基互補(bǔ)配對(duì)TACG（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)

（Watson,Crick,1953）穩(wěn)定因素：氫鍵維持橫向穩(wěn)定性堿基堆積力維持縱向穩(wěn)定性其他作用因素4.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性三種類型DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)5.與DNA堿基序列相關(guān)的特殊結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)鏡像重復(fù)二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤(pán)繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋(positivesupercoil)盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方同相同負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方向相反意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對(duì)于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程具有關(guān)鍵作用。（二）原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)（三）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是核小體(nucleosome)。核小體的化學(xué)組成DNA：約200bp組蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4染色體的組裝過(guò)程：核小體串珠狀染色質(zhì)細(xì)絲中空線圈螺線管染色單體壓縮了1000-2000倍多級(jí)螺旋模型壓縮倍數(shù)76405（8400）

DNA→核小體→螺線管→超螺線管→染色單體

2nm10nm30(10)nm400nm2~10μm

一級(jí)包裝二級(jí)包裝三級(jí)包裝四級(jí)包裝

三、DNA的功能以基因的形式儲(chǔ)存、傳遞、表達(dá)信息

DNA-----RNA-----蛋白質(zhì)基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。第三節(jié)

RNA的結(jié)構(gòu)與功能StructureandFunctionofRNARNA的種類、分布、功能一、信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能hnRNAmRNA*真核生物mRNA成熟過(guò)程內(nèi)含子（intron）外顯子（exon）*真核生物mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)5′末端有甲基化鳥(niǎo)苷帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-

2.3′末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。帽子結(jié)構(gòu)促進(jìn)mRNA由胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位維持mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的調(diào)控帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能*mRNA的功能把DNA的堿基序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸順序。DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細(xì)胞*

tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含10~20%稀有堿基3′末端為—CCA-OH5′末端大多數(shù)為G具有T

C環(huán)二、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的結(jié)構(gòu)與功能N,N二甲基鳥(niǎo)嘌呤N6-異戊烯腺嘌呤雙氫尿嘧啶4-巰尿嘧啶

稀有堿基*tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——三葉草形

氨基酸臂

DHU環(huán)

反密碼子環(huán)額外環(huán)

TΨC環(huán)氨基酸臂額外環(huán)*tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)——倒L形*tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。*rRNA的結(jié)構(gòu)三、核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）沉降系數(shù)：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)的沉降速度真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA核蛋白體的組成核酸的理化性質(zhì)ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第四節(jié)核酸的酸堿及溶解度性質(zhì)核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性，其中的堿基又具有堿性，所以為兩性電解質(zhì)?？膳c金屬離子成鹽，不溶于乙醇或異丙醇。核酸的高分子性質(zhì)粘度：DNA>RNAdsDNA>ssDNA沉降行為核酸的紫外吸收(OD260)單核苷酸>ssDNA(或RNA)>dsDNA核酸的分離方法：電泳-------依據(jù)分子量大小離子交換法-----依據(jù)電荷一、核酸的一般理化性質(zhì)1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0OD260的應(yīng)用二、DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈的過(guò)程。方法：過(guò)量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度對(duì)A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。Tm：DNA變性時(shí)紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。影響Tm的因素：大小、G+C含量三、DNA的復(fù)性與分子雜交

DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。減色效應(yīng)

DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低的現(xiàn)象。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程稱為退火(annealing)。不同來(lái)源的核酸鏈分子復(fù)性時(shí)形成雜化雙鏈過(guò)程叫分子雜交。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization)核酸分子雜交的應(yīng)用研究DNA分子中某一種基因的位置確定兩種核酸分子間的序列相似性檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)

核酸酶

核酸酶是指所有可以水解核酸的酶

核酸酶的分類依據(jù)底物不同分類DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：專一降解DNA。RNA酶(ribonuclease,RNase)：專一降解RNA。依據(jù)切割部位不同核酸內(nèi)切酶：分為限制性核酸內(nèi)切酶和非特異性限制性核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶：5′→3′或3′→5′核酸外切酶。參與DNA的合成與修復(fù)、RNA合成后的剪接等重要基因復(fù)制和基因表達(dá)過(guò)程負(fù)責(zé)清除多余的、結(jié)構(gòu)和功能異常的核酸，同時(shí)也可以清除侵入細(xì)胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收體外重組DNA技術(shù)中的重要工具酶生物體內(nèi)的核酸酶負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)外催化核酸的降解

核酸酶的功能

核酶---有催化活性的RNA1982年，美國(guó)ThomasCech

在研究四膜蟲(chóng)rRNA自我剪接時(shí)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)加拿大的SidneyAltman發(fā)現(xiàn)RNaseP分子中的RNA組分有催化活性；1989年分享了Noble化學(xué)獎(jiǎng)。不僅拓寬了生物催化劑的領(lǐng)域，而且對(duì)RNA的生物學(xué)功能開(kāi)創(chuàng)了一種歷史性的新認(rèn)識(shí)：RNA不僅具有儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的功能，而且還具有生物催化劑的功能，在一定程度上可以說(shuō)，RNA一身兼有DNA和蛋白質(zhì)兩大類生物大分子的功能。催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脫氧核苷酸片段，也能序列特異性降解RNA。催化性RNA(ribozyme)

作為序列特異性的核酸內(nèi)切酶降解mRNA。核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于催化活性很重要。Symons提出“錘頭”（hammerhead）狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。三個(gè)螺旋區(qū)；13（或11）個(gè)保守核苷酸序列。核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，更有效去除蛋白質(zhì)。氯仿還可加速有機(jī)相與水相的分層。異