醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)復(fù)習(xí)重點(diǎn)

PAGEPAGE5分子生物學(xué)需要掌握的重點(diǎn)DNA、RNA、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、基因、端粒、聚合酶、密碼子、突變、變性的概念或結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及特點(diǎn)；復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾、靶向輸送的主要過(guò)程及特點(diǎn)；癌基因的概念、原癌基因產(chǎn)物的類型及細(xì)胞定位、癌基因活化致癌的主要機(jī)制；常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理、主要步驟、酶學(xué)及特點(diǎn)；基因表及其調(diào)控的原理、主要過(guò)程或步驟，乳糖操縱子的正、負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制；常用的基因診斷及基因治療技術(shù)；基因克隆、基因診斷、基因治療、管家基因、抑癌基因、Klenow片段、核蛋白體、限制性內(nèi)切核酸酶、人類基因組計(jì)劃、原位雜交的概念；雙脫氧末端終止法DNA測(cè)序、重組DNA技術(shù)的主要步驟；結(jié)構(gòu)基因、順式作用元件、啟動(dòng)子、遺傳密碼、反式作用因子、氨基酰-tRNA、基因組文庫(kù)、DNA多態(tài)性、轉(zhuǎn)位因子、探針、Tm值、DNA微陣列、DNA甲基化的概念、性質(zhì)；核酸分子雜交的主要類型、PCR的主要步驟及引物設(shè)計(jì)；DNA、RNA及多肽鏈的合成方向；真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本方法；細(xì)胞周期的主要調(diào)控點(diǎn)；DNA損傷及修復(fù)的主要類型和機(jī)制；基因文庫(kù)篩選的主要方法及原理。名詞解釋質(zhì)粒——是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)攜帶的染色體外的DNA分子，是共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒只有在宿主細(xì)胞內(nèi)才能夠完成自己的復(fù)制?；颉纲A存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列及表達(dá)這些信息所需的全部核苷酸序列，是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位。癌基因——是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性，它的結(jié)構(gòu)異常或表達(dá)異常，可以引起細(xì)胞癌變?；蚩寺　侵赴岩粋€(gè)生物體的遺傳信息（基因片段）轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，得到一群完全相同的基因片段，又稱DNA克隆。抑癌基因——是指存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一大類可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并具有潛在抑癌作用的基因，當(dāng)這類基因在發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。基因診斷——是以DNA和RNA為診斷材料，通過(guò)檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程。管家基因——是在生命過(guò)程都是必需的，是在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因，它較少受環(huán)境因素的影響，其表達(dá)方式為組成性基因表達(dá)。klenow片段——亦稱DNA聚合酶1大片段，為DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解后產(chǎn)生的大片段，它除了保留5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切酶活性外，失去了5′→3′外切酶活性，它具有的3′→5′外切酶活性能保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，把DNA合成過(guò)程中錯(cuò)誤配對(duì)的堿基去除，再把正確的核苷酸接上去。核蛋白體——系tRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成的一種復(fù)合體，是蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。限制性內(nèi)切核酸酶——能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切核酸酶，是基因克隆中最重要的工具酶，通常所說(shuō)的限制酶是指2型酶。主要從原核細(xì)胞中提取，大多數(shù)限制性內(nèi)切酶是錯(cuò)位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生粘性末端，部分酶則沿對(duì)稱軸切割DNA而產(chǎn)生平端。Tm值——DNA變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度（Tm），其大小與G+C含量成正比。或:雙鏈DNA變性一半所需要的溫度叫DNA的融解溫度.DNA的甲基化——是指DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過(guò)加上一個(gè)甲基而被修飾，其作用是對(duì)自身DNA產(chǎn)生保護(hù)作用。原位雜交——是核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交的方法。DNA微陳列——系直接將大量DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面所組成的微陳列（基因芯片）稱為DNA微陳列。.順序作用元件——是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，能被基因調(diào)控蛋白異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列,抱括啟動(dòng)子.上游啟動(dòng)子元件.增強(qiáng)子.加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件。轉(zhuǎn)位因子—是指能夠在一個(gè)DNA分子內(nèi)或2個(gè)DNA分子之間移動(dòng)的DNA片段?；蛑委?-是指通過(guò)在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)的基因，或采用特定方式關(guān)閉和抑制異常表達(dá)基因，達(dá)到治療疾病目的的治療方法?；蛇M(jìn)行多種共價(jià)修飾，包括；磷酸化，羥基化，ADP-核糖基化，形成胱氨酸及乙酰化。③翻譯過(guò)程涉及多種分子之間的相互作用，可以歸納為：RNA-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及RNA-RNA相互作用。④參與翻譯終止的蛋白質(zhì)因子包括：RF、PR、IF。⑤廣義的核蛋白體循環(huán)包括：翻譯起始，進(jìn)位，成肽，轉(zhuǎn)位和翻譯終止。真核生物mRNA的加工包括：①5′端加帽（由加帽酶催化5′端加入7-甲苷烏苷酸，形成帽子結(jié)構(gòu)m7GpppmNP-）。②3′端加入Poly(A)尾（A、組蛋白的成熟mRNA無(wú)需加polyA尾；B、加尾信號(hào)包括AAUAAA和富含GU的序列；C、加尾不需模板；D剪切過(guò)程需要多種蛋白質(zhì)因子的輔助）。③mRNA前體的剪接（剪接加工以除去內(nèi)含子序列，并將外顯子序列連接成為成熟的有功能的mRNA分子。內(nèi)含子兩端的結(jié)構(gòu)通常是5′-GU……AG-3′。選擇性剪接的作用機(jī)制包括；A使用不同的剪接位點(diǎn)，B選擇使用外顯子，C、反式剪接，D、使用不同的啟動(dòng)子，E、使用不同的多腺苷酸化位點(diǎn)）。④RNA的編輯（發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平，改編mRNA序列，C→U或A→G，增加遺傳信息容量）?；虮磉_(dá)是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程。但并非所有基因表達(dá)過(guò)程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)，tRNA、rRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄生成RNA的過(guò)程也屬于基因表達(dá)?；虮磉_(dá)受到多級(jí)水平的調(diào)控，具有階段特異性（時(shí)間特異性）和組織特異性（空間特異性）。基因表達(dá)分為幾個(gè)階段：基因活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工等、產(chǎn)物是RNA和有功能的蛋白質(zhì)。原核生物基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)，主要在轉(zhuǎn)錄水平，其次是翻譯水平。原核生物基因多以操縱子的形式存在，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控涉及到啟動(dòng)子、σ因子（能與RNA聚合酶結(jié)合）、阻遏蛋白(負(fù)調(diào)控)、正調(diào)控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰減子等多種因素。而翻譯水平的調(diào)控涉及到SD序列（位于AUG前）、mRNA的穩(wěn)定性（不穩(wěn)定，其5′端和3′端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可保護(hù)其不被酶水解，mRNA的5′端與核糖體結(jié)合，可明顯提高其穩(wěn)定性）、翻譯產(chǎn)物及小分子RNA的調(diào)控作用。真核生物基因表達(dá)的調(diào)控環(huán)節(jié)較多，在DNA水平可通過(guò)染色體丟失，基因擴(kuò)增、基因重排、DNA甲基化以及染色體結(jié)構(gòu)改變影響基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平則主要通過(guò)反式作用因子的作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與TATA盒的結(jié)合、RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子-DNA復(fù)合物的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成；在轉(zhuǎn)錄后水平主要通過(guò)RNA修飾、剪接及mRNA運(yùn)輸?shù)目刂苼?lái)影響基因表達(dá)；影響翻譯水平的因素有影響起始翻譯的阻遏蛋白、5′AUG、5′端非編碼區(qū)的長(zhǎng)度、mRNA的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)及小分子RNA等。真核基因調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)是基因轉(zhuǎn)錄，真核生物基因表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子、沉默子和增強(qiáng)子。反式作用因子：指能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，其主要特點(diǎn)包括三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域（DNA識(shí)別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域、結(jié)合其它蛋白的結(jié)合域）、能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)的順式作用元件、對(duì)基因表達(dá)有正性和負(fù)性調(diào)控作用。其活性調(diào)節(jié)方式：表達(dá)式調(diào)節(jié)，共價(jià)修飾，配體結(jié)合及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。作用方式:成環(huán)、扭曲、滑動(dòng)、Oozing。DNA結(jié)構(gòu)域包括：鋅指、螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋、亮氨酸拉鏈和螺旋—環(huán)—螺旋。轉(zhuǎn)錄激活域富含：酸性氨基酸、脯氨酸和谷氨酰胺。參與DNA復(fù)制（合成）的物質(zhì)包括：①模板（解開(kāi)成單鏈的DNA母鏈）。②引物（提供3’—OH未端使dNTP可以依次聚合）。③底物（dATP，dGTP，dCTP和dTTP）。④聚合酶（依賴DNA的DNA聚合酶（DNA—pol））。⑤其它的酶和蛋白質(zhì)因子。DNA復(fù)制的基本過(guò)程包括：①DNA雙鏈解開(kāi)，②RNA引物的合成，③DNA鏈的延長(zhǎng)，④切除引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰DNA片段，⑤結(jié)構(gòu)基因突變的類型包括點(diǎn)突變、缺失、插入和倒位四類，遺傳密碼的改變分為錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、同義突變和移碼突變。癌基因惡性激活的機(jī)制包括：①原癌基因點(diǎn)突變，②原癌基因獲得外源啟動(dòng)子而激活，③原癌基因因甲基化程度降低而激活，④基因易位或重排使原癌基因激活。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是基因治療中最常用的載體。造血肝細(xì)胞是基因治療中最重要的靶細(xì)胞，禁用生殖細(xì)胞。基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(基因治療技術(shù))包括生物學(xué)方法和非生物學(xué)方法:生物學(xué)方法有:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體.腺病毒載體.腺相關(guān)病毒載體.單純皰疹病毒載體;非生物學(xué)方法有：脂質(zhì)體、直接注射、受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、DNA—磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、顯微注射、顆粒轟擊。DNA甲基化的一個(gè)特點(diǎn)是它們經(jīng)過(guò)細(xì)胞許多代分裂之后仍保持穩(wěn)定。在真核生物DNA中，幾乎所有甲基化均發(fā)生于二核苷酸序列5’—mCG—3一個(gè)基因所包括的序列有：編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA的核酸序列、保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列、位于編碼區(qū)5’啟動(dòng)子是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列,啟動(dòng)子具有方向性，真核生物的啟動(dòng)子必須與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，才能被DNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合，真核生物的啟動(dòng)子元件是TATA蓋,TATA盒的核心序列是TATA(A/T)A(A/T)，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游—25bp處,啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄方向.模板鏈及轉(zhuǎn)錄效率。上游啟動(dòng)子元件包括：CAAT盒，CACA盒和GC盒。逆轉(zhuǎn)錄：是指以RNA為模板，利用宿主細(xì)胞中4種dNTP為原料，在引物的3'端以5'→3'方向合成與RNA互補(bǔ)的DNA鏈的過(guò)程，此過(guò)程與中心法則方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。原癌基因產(chǎn)物的類型及細(xì)胞定位①生長(zhǎng)因子及其類似物，由細(xì)胞分泌，如C-sis家族（sis編碼血小板源生長(zhǎng)因子，表達(dá)產(chǎn)物與PDGF鏈結(jié)構(gòu)同源）。②跨膜生長(zhǎng)因子受體型的酪氨酸蛋白激酶，如erb-B,表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）受體；fims,巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體；定位于質(zhì)膜。③細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子，定位于胞夜,包括A、低分子量G蛋白，如H-ras等基因表達(dá)產(chǎn)物；B、胞內(nèi)蛋白激酶（包括與膜結(jié)合的蛋白酪氨酸激酶和胞漿絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶），如src、abl。④核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子：如myc、fos等，定位于細(xì)胞核內(nèi)。⑤胞漿調(diào)節(jié)蛋白，如crk的產(chǎn)物是存在于胞漿中的調(diào)節(jié)蛋白，定位于胞漿。⑥可溶性蛋白酪氨酸激酶受體和非蛋白激酶受。細(xì)胞周期的主要調(diào)控點(diǎn)細(xì)胞周期的運(yùn)行受多種因素所調(diào)控，有2個(gè)主要調(diào)控點(diǎn)，亦稱為檢測(cè)點(diǎn)。①G1/S期檢測(cè)點(diǎn)：在酵母中稱起點(diǎn)，在哺乳細(xì)胞中稱限制點(diǎn),是控制細(xì)胞進(jìn)入S期檢測(cè)點(diǎn)（G1期檢測(cè)點(diǎn)）,cyclinb與cdk4和CDK6結(jié)合，cycline與CDK2，CDk3結(jié)合，通過(guò)磷酸化使它們活化。cyclin-CDk復(fù)合物可使Rb蛋白磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2f，促進(jìn)dna復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)。cdk2也可和cyclinA、cyclinA1結(jié)合，促進(jìn)早S期Dna合成的起始。②G2/M期檢測(cè)點(diǎn)：是控制細(xì)胞進(jìn)入M期檢測(cè)點(diǎn)（G2期檢測(cè)點(diǎn)），促有絲分裂因子（MPF）由cyclinb和CDk1組成，是啟動(dòng)有絲分裂的關(guān)鍵因子。細(xì)胞何時(shí)進(jìn)入M期取決于cdc2的磷酸化狀態(tài)。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本方法：①磷酸鈣沉淀法。②電穿孔法。③脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因?qū)敕?。④DEAE-葡聚糖法。⑤顯微注射法。DNA損傷的主要類型①堿基和糖基破壞②錯(cuò)配③DNA鏈斷裂：電離輻射致DNA損傷的主要形式④DNA變聯(lián)。上述DNA損傷可導(dǎo)致DNA模板發(fā)生堿基的置換、插入、缺失、鏈的斷裂，并可影響到染色體的高級(jí)結(jié)構(gòu)。DNA鏈中一種嘌呤被另一種嘌呤取代，或嘧啶被另一種嘧啶所取代，稱為轉(zhuǎn)換；嘌呤被嘧呤取代，或反之，稱為顛換；轉(zhuǎn)換和顛換在DNA復(fù)制時(shí)可引起堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致基因突變；堿基的插入和缺失可引起移碼突變。DNA修復(fù)機(jī)制的主要類型①光修復(fù)；②切除修復(fù)；③重組修復(fù)；④SOS修復(fù)；⑤錯(cuò)配修復(fù)。基因文庫(kù)篩選的主要方法及原理根據(jù)抗藥性標(biāo)志篩選：對(duì)于帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，只有轉(zhuǎn)化成功的受體菌才可能在含該抗生素的培養(yǎng)基中生存并形成菌落；而沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功的受體菌，不能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以此可選擇陽(yáng)性菌。(2)根據(jù)菌落的呈色反應(yīng)篩選（互補(bǔ)、藍(lán)-白篩選）：根椐菌落的顏色并結(jié)合插入片段的序列測(cè)定篩選。(3)營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記法:(4)核酸分子雜交法：即采用與目的基因部分互補(bǔ)的DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，以確定重組體中帶目的基因。包括原位雜交和southern印跡雜交。（5）遺傳互補(bǔ)法：載體上的營(yíng)養(yǎng)代謝標(biāo)記可以對(duì)宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝缺陷進(jìn)行互補(bǔ)，以此作為篩選重組體的標(biāo)記。（6）免疫學(xué)方法：如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可以用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體，通過(guò)放射免疫、化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選。pcr的主要步驟及引物設(shè)計(jì)的基本要求①pcr的主要步驟：pcr又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在體外進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)過(guò)程。其基本過(guò)程包括：A、雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈(變性),溫度95度左右。B、在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)(退火),85-90度。C、延伸：在四種dntp底物及mg2+存在條件下，TaqDNA聚合酶在最適作用溫度（70~75℃）下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，從特異結(jié)合到DNA模板上的引物3′-OH端開(kāi)始摻入單核苷酸，合成新的DNA分子。②引物設(shè)計(jì)的基本要求：A、引物長(zhǎng)度一般為15~30個(gè)核苷酸。B、引物中的堿基組成盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，尤其在3′端避免連續(xù)3個(gè)G或C。C、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過(guò)3bp。D、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊。E、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列。F、引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的5′乳糖操縱子的正、負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制乳糖操縱子包含3個(gè)結(jié)構(gòu)基因Z.Y.A（編碼β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷通透酶和轉(zhuǎn)乙?；福?個(gè)調(diào)控元件（啟動(dòng)子、操縱基因和cAP結(jié)合位點(diǎn)）和1個(gè)調(diào)節(jié)基因（編碼阻遏蛋白）。乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始是由CAP和阻遏蛋白兩種調(diào)控因子來(lái)調(diào)控的。（1）阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控：無(wú)乳糖時(shí)，阻遏蛋白結(jié)合操縱基因，妨礙RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子，從而抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。有乳糖時(shí)，生成半乳糖（誘導(dǎo)劑）結(jié)合阻遏蛋白，使阻遏蛋白構(gòu)象改變，變構(gòu)的阻遏蛋白不能與操縱序列結(jié)合，阻遏機(jī)制解除，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄，基因得以表達(dá)。③camp-cap復(fù)合物的正調(diào)控:無(wú)葡萄糖時(shí)，cAMP濃度高，形成的cAMP-caP復(fù)合物結(jié)合于cap結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)下游基因得以表達(dá)；有葡萄糖時(shí)，cAMP濃度低，cAMP-cAP復(fù)合物形成受阻，影響轉(zhuǎn)錄活性。④正、負(fù)調(diào)控機(jī)制相輔相成：cAMP-cAP復(fù)合物是轉(zhuǎn)錄必需的，同時(shí)阻遏蛋白進(jìn)一步控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。綜上，乳糖操縱子最強(qiáng)的表達(dá)條件是有乳糖而無(wú)葡萄糖。雙脫氧末端終止法DNA測(cè)序的主要步驟：雙脫氧末端終止法是以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。其主要步驟為：①制備單鏈模板。②模板與測(cè)序引物結(jié)合。③摻入法標(biāo)記反應(yīng)。④延伸-終止反應(yīng)。⑤變性膠電泳。⑥放射自顯影。⑦閱讀測(cè)序結(jié)果。常用的分子生物學(xué)技術(shù)的原理、過(guò)程及特點(diǎn)①核酸分子雜交技術(shù)：基本原理是：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過(guò)程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及復(fù)性過(guò)程中各分子間鍵的形成和斷裂等。特點(diǎn)：直接檢測(cè)血清中病毒基因組，無(wú)須擴(kuò)增，靈敏度較PCR低。在雜交體系中已知的核酸序列稱作探針。②聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：PCR的原理是根據(jù)待測(cè)DNA片段兩端的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并人工合成兩個(gè)分別與DNA片段兩端互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物，在有過(guò)量的引物、過(guò)量的底物（4種dNTP）、dna聚合酶以及模板（待擴(kuò)增片段的DNA分子）的反應(yīng)體系中，經(jīng)過(guò)高溫變性（使DNA鏈解開(kāi)）、低溫退火（使引物與模板結(jié)合）和適溫延伸（新合成的DNA片段）三個(gè)階段的循環(huán)周期，對(duì)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增。特點(diǎn):極強(qiáng)的擴(kuò)增能力,度高靈敏性,高度特異性，只需微量模板,只需數(shù)小時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物量大,變性.復(fù)性.延伸三個(gè)步聚循環(huán)進(jìn)行,操作簡(jiǎn)便，適用廣泛，但可出現(xiàn)假陽(yáng)性.③DNA序列測(cè)定：DNA序列測(cè)定是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，包括Sanger雙脫氧鏈末端終止法和化學(xué)降解法。Sanger法的基本原理是：雙脫氧核苷酸（ddNTP）在DNA合成過(guò)程中代替相應(yīng)的脫氧核苷酸（dNTP）作為底物，不能形成3′，5′-磷酸二酯鍵而導(dǎo)致鏈延伸終止。化學(xué)降解法：是采用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA單鏈片段，造成堿基特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按分子大小分離和放射自顯影，直接讀出待測(cè)DNA的核苷酸順序。④DNA芯片技術(shù)：DNA芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相核酸分子雜交，以大量已知堿基序列的寡核苷酸片段為探針，檢測(cè)樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過(guò)定性、定量分析得出待測(cè)樣品的基因序列及表達(dá)的信息。DNA芯片的主要技術(shù)流程包括：芯片的設(shè)計(jì)與制備、靶基因的標(biāo)記（常用熒光色素.生物素或放射性核素標(biāo)記dNTP）、芯片雜交與雜交信號(hào)檢測(cè)。特點(diǎn)：高通量.鑒別診斷。酶：DNA聚合酶。所需探針：合成的寡核苷酸片段，cDNA，已克隆的基因片段，雙鏈或單鏈DNA或RNA，肽核酸。⑤基因克隆技術(shù)（重組DNA技術(shù)）：基因克隆是指某種目的基因的擴(kuò)增與分離過(guò)程，具體是從基因組或DNA大片段中分離并獲得某一特定的基因或DNA片段，再通過(guò)DNA序列擴(kuò)增形成由眾多拷貝組成的DNA拷貝群體的過(guò)程。其基本過(guò)程為：A-目的基因的制備；栽體的選擇與制備；B-DNA分子的體外連接；C-將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞；D-目的基因的篩選與鑒定；E-DNA重組體的擴(kuò)增與表達(dá)原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)比較：①兩者均涉及RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（啟動(dòng)子等）的相互作用。②真核需要多種轉(zhuǎn)錄因子輔助、原核不需要。③真核以正調(diào)控為主，原核以負(fù)調(diào)控為主。④真核3種RNA聚合酶負(fù)責(zé)不同種類基因的轉(zhuǎn)錄，原核只有1種RNA聚合酶。原核生物和真核生基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)的比較。①相同點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)②不同點(diǎn)：A、原核基因表達(dá)調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄和翻譯水平；真核基因表達(dá)調(diào)控主要包括染色質(zhì)活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工多個(gè)層次。B、原核基因表達(dá)調(diào)控主要為負(fù)調(diào)節(jié)，真核主要為正調(diào)節(jié)。C、原核轉(zhuǎn)錄起始不需要轉(zhuǎn)錄因子，RNA聚合酶直接結(jié)合啟動(dòng)子，由σ因子決定基因表達(dá)的特異性；真核轉(zhuǎn)錄起始需要基礎(chǔ)、特異兩類轉(zhuǎn)錄因子，依賴DNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活。D、原核基因表達(dá)調(diào)控主要采用操縱子模型，轉(zhuǎn)錄出多順?lè)醋覴NA，實(shí)現(xiàn)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)；真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋覴NA，功能相關(guān)蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達(dá)機(jī)制更為復(fù)雜。質(zhì)粒的特征：①原核細(xì)胞中染色體外的共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子。②能獨(dú)立于細(xì)胞的染色體而進(jìn)行復(fù)制，并依賴于宿主細(xì)胞。③在同一宿主中具有不相容性，即具有相同復(fù)制起始位點(diǎn)和分配區(qū)的兩種質(zhì)粒不能共存于一個(gè)宿主菌。④具有嚴(yán)格的遺傳控制系統(tǒng)（復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)，分配系統(tǒng)，細(xì)胞分裂控制系統(tǒng)，位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)）。⑤其所攜帶的遺傳信息能賦予宿主細(xì)胞特定的遺傳性狀。⑥是DNA重組技術(shù)中所使用的主要載體。作為克隆載體的質(zhì)粒具有的特點(diǎn)：分子量較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)；具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志；具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入。真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)。①每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目，體細(xì)胞一般為雙倍體。②真核基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起點(diǎn)。③真核基因組由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?，即一分子mRNA只能翻譯一種蛋白質(zhì)。④真核生物分子含有大量重復(fù)順序。⑤真核生物基因組內(nèi)非編碼的順序占90%以上。⑥真核基因是斷裂基因。⑦功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族。⑧真核生物基因組中也存在一些可移動(dòng)的遺傳因素。蛋白質(zhì)生物合成后的靶向輸送過(guò)程及特點(diǎn)：蛋白質(zhì)合成后，定向地被輸送到最終發(fā)揮生物學(xué)功能的部位稱為靶向輸送。靶向輸送的蛋白質(zhì)的N端往往有一些特異的氨基酸序列，稱為信號(hào)序列，是決定蛋白質(zhì)靶向輸送特性的重要元件，通過(guò)信號(hào)序列引導(dǎo)蛋白質(zhì)從胞漿進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng).線粒體.葉綠體和核內(nèi)，靶向不同的蛋白質(zhì)各有特異的信號(hào)序列。分泌型蛋白合成后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)加工，包裝成分泌小泡，再轉(zhuǎn)移.融合到靶部位或分泌出細(xì)胞，其靶向輸送主要靠信號(hào)肽與胞漿中的信號(hào)肽識(shí)別粒子（SRP）識(shí)別并特異結(jié)合，然后再通過(guò)SRP與膜上的對(duì)接蛋白（DP）識(shí)別并結(jié)合后，將所攜帶的蛋白質(zhì)送出細(xì)胞；線粒體蛋白的靶向輸送靠導(dǎo)肽與多種蛋白復(fù)合體介導(dǎo)進(jìn)入基質(zhì)和膜間腔，然后自發(fā)的或在分子伴侶HSP70幫助下折疊形成有功能的蛋白質(zhì)；而細(xì)胞核蛋白的靶向輸送則通過(guò)核定位信號(hào)與核輸入受體結(jié)合形成核蛋白-受體復(fù)合物，被導(dǎo)出核孔，再與核孔復(fù)合體結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核。核酸分子雜交的基本方法包括：Southern印跡雜交（鑒別DNA靶分子的雜交、待測(cè)核酸是DNA片段）、Northern