現(xiàn)代生物制藥技術(shù)

生物制藥技術(shù)第二章基因工程制藥第三章細胞工程制藥第四章酶工程制藥第五章動植物細胞培養(yǎng)技術(shù)制藥第六章生物藥物的提取純化技術(shù)第一章緒論1整理ppt

第一章緒論第一節(jié)生物制藥的概念和內(nèi)容生物制藥是指利用生物體或生物過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。分類：發(fā)酵工程制藥基因工程制藥細胞工程制藥酶工程制藥2整理ppt第二節(jié)生物藥物的性質(zhì)與分類生物藥物的性質(zhì)優(yōu)點：毒性低、副作用小、療效可靠。特異性特別要提到的是利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的藥品，即新生物技術(shù)藥品，或簡稱生物新藥。劣點：1成分復(fù)雜

2

不穩(wěn)定、易變性、易失活

3

易為微生物污染、破壞

4生產(chǎn)條件的變化對產(chǎn)品質(zhì)量影響較大3整理ppt

二生物新藥的質(zhì)量保證要點：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、平安性、穩(wěn)定性和抑制性。鑒定方法電泳方法、免疫學(xué)分析方法、受體結(jié)合實驗、各種高效液相色譜分析法、肽圖分析法、EdmanN-末端序列分析法、圓二色譜法、核磁共振法平安性評價無病毒、無菌、無熱源、無致敏源致突變、致癌和致畸4整理ppt

三生物藥物的分類1氨基酸類2有機酸、醇酮類3維生素4酶及輔酶類〔1〕酶類藥物：助消化酶類；消炎酶類；心血管疾病治療酶；抗腫瘤酶；其他酶類：超氧化物歧化酶〔SOD〕PEG-腺苷脫氨酶RNA酶〔2〕輔酶類藥物：ATPNADCoAFAD5脂類〔1〕磷脂類5整理ppt〔2〕多價不飽和脂肪酸〔PUFA〕和前列腺素〔3〕膽酸類〔4〕固醇類〔5〕卟啉類6多肽和蛋白質(zhì)類人體內(nèi)的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和細胞生長因子。紅細胞生成素〔EPO〕白細胞介素-2〔IL-2〕粒細胞集落刺激因子〔G-CSF〕粒/巨噬細胞集落刺激因子〔GM-CSF〕腫瘤壞死因子〔TNF〕表皮生長因子〔EGF〕〔用于傷口愈合〕6整理ppt7核酸類及其衍生物〔1〕核酸類〔2〕多聚核苷酸〔3〕核苷、核苷酸及其衍生物8多糖升白：增加白細胞〔1〕抗生素〔2〕酶抑制劑〔3〕免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)〔4〕其他生物活性物質(zhì)7整理ppt第三節(jié)新型生物藥物研制的理論和方法新的化學(xué)實體〔Newchemicalentity，簡稱NCE〕根據(jù)NCE來源將生物藥物大致分為兩類：一類是利用重組DNA技術(shù)二類是利用微生物、動植物或酶生產(chǎn)的非上述藥品，通過篩遠可獲得這類新藥的NCE的先導(dǎo)物。新藥研究和開發(fā)的主要過程：1確定研究方案2準備化合物3藥理篩選4化學(xué)試驗5臨床前I期6臨床前II期7I期臨床8II期臨床9III期臨床10注冊申請上市11售后監(jiān)測8整理ppt提供6000-8000個化合物9-13年耗資約2.3億美元先導(dǎo)化合物的尋找9整理ppt1篩選模型確實定篩選模型的核心是藥物作用靶大規(guī)模篩選〔High-throughputscreening，簡稱HTS〕〔1〕用動物細胞和組織建立的篩選模型LC50〔2〕酶抑制劑的篩選〔3〕受體拮抗劑的篩選基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄因子為對象的治療〔1〕轉(zhuǎn)錄因子的多樣性〔2〕轉(zhuǎn)錄因子具有特異性〔3〕基因特異性轉(zhuǎn)錄因子與人類疾病有關(guān)10整理ppt開始考慮以凋亡為靶治療2先導(dǎo)化合物來源一是從化學(xué)庫或天然產(chǎn)物中篩選二是與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)設(shè)計〔合理新藥設(shè)計〕合理藥物設(shè)計〔Rationaldrugdesign〕那么是基于受體三維立體結(jié)構(gòu)的認識，通過計算機輔助分子設(shè)計全程合成新分子?，F(xiàn)今從生物中篩選新藥重點放在微生物人們也開始關(guān)注植物、動物人類和動物方面，那么關(guān)注自身免疫系統(tǒng)新藥的研究與開發(fā)是一個將化學(xué)結(jié)構(gòu)研究與生物活性研究連接起來的創(chuàng)造性過程。11整理ppt第四節(jié)生物藥物的開展歷史和概況生物制藥的開展歷史李時珍?本草綱目?醫(yī)生琴納〔Jenner〕創(chuàng)造了用牛痘疫苗治療天花1860年，巴斯德發(fā)現(xiàn)細菌，開創(chuàng)了第一次藥學(xué)革命1928年英國弗萊明創(chuàng)造青霉素至1941年在美國開發(fā)成功。從生物體內(nèi)別離純化酶制劑的技術(shù)日趨成熟，酶類藥物得到廣泛應(yīng)用。70年代Zenk應(yīng)用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物藥物50年代提出的DNA雙螺旋理論及70年代開展的重組DNA12整理ppt技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)使生物制藥進入一嶄新的時代1982年，第一個基因工程藥物人胰島素上市另一重大認識就是認識到生物多樣性對生物制藥的決定性在基因工程和細胞工程技術(shù)方面的研究水平與國外水平相比差距已不大，國內(nèi)已建立了40多個臨床藥理試驗基地。二生物制藥的開展概況1基因工程所依托的根底理論為Watson-Crick的DNA模板學(xué)說、Monod和Jacob的操縱子學(xué)說。13整理ppt〔1〕基因工程藥物品種的開發(fā)〔2〕應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型〔3〕應(yīng)用基因工程技術(shù)改進菌種〔4〕基因工程技術(shù)在改進藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用〔5〕利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物〔6〕基因工程抗體在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用抗體工程細胞工程奠定了細胞培養(yǎng)和細胞融合技術(shù)的理論根底〔1〕單克隆抗體技術(shù)生物導(dǎo)彈14整理ppt〔2〕通過植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物〔3〕動物細胞培養(yǎng)三微生物工程微生物工程也稱發(fā)酵工程所采用的新技術(shù)主要應(yīng)用于3個方面：工藝改進、新藥研制和菌種改造。微生物藥物：即在微生物生命活動過程中產(chǎn)生的具有生理活性〔或稱藥理活性〕的次級代謝產(chǎn)物及其衍生物。有酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑、抗氧化劑。15整理ppt

四酶工程酶工程是酶學(xué)與化工技術(shù)二者結(jié)合的產(chǎn)物第五節(jié)生物制藥的開展趨勢一生物制藥中的新技術(shù)1大規(guī)模篩選的采用與創(chuàng)新大規(guī)模篩選是大規(guī)模測試化合物的方法，采用機器人自動尋找特殊生物靶，如某個細胞外表受體或一個代謝有關(guān)酶的抑制劑〔拮抗劑〕或沖動劑〔興奮劑〕的技術(shù)。2高效別離純化系統(tǒng)的采用〔1〕固相化金屬親和層析〔2〕超擴散層析16整理ppt〔3〕灌注層析BioCADworkstation〔4〕其他快速別離純化系統(tǒng)AKTAexplorer快速化工工藝開拓系統(tǒng)Streamline擴張柱床吸附技術(shù)快速蛋白液相色譜〔FPLC〕Thebiologicalsystem高分辨生物分子純化而設(shè)計的層析系統(tǒng)二Humangenomeproject，簡稱HGP約10萬個gene30億對堿基17整理ppt

三基因治療基因治療從基因角度可以理解為將外來的基因?qū)爰毎?，用正常的基因置換病源基因或補充缺失的基因，從而到達治療的效果?；蛑委煹募膊∮腥悾褐滤佬赃z傳性疾病用過去的治療法很難根治的癌癥愛滋病等后天性疾病RNA病毒可望用RNA酶消滅圖1-4為用核酸酶〔RNA酶〕18整理ppt19整理ppt20整理ppt解決的問題：提供更多可供利用的基因設(shè)計定向整合的載體：反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒人類將逐漸具備在原子水平解決問題和在基因水平上治療疾病的能力。四糖鏈工程糖科學(xué)〔Glycoscience〕和糖鏈工程即糖生物學(xué)蛋白或糖脂類對生態(tài)信息的傳遞起著重要的作用糖類藥物21整理ppt

五

細胞因子類藥物

細胞因子是淋巴細胞來源的淋巴因子或巨噬細胞、單核細胞來源的單核因子、免疫系統(tǒng)中具有各種生物活性的一類因子的總稱。對細胞因子的受體結(jié)構(gòu)以及細胞因子糖鏈局部的結(jié)構(gòu)和功能也做了大量研究。22整理ppt第二章基因工程制藥第一節(jié)基因工程制藥概述基因工程〔Geneengineering〕，又稱重組DNA技術(shù)。它能使帶有支配各種各樣遺傳信息基因的DNA片段越過不同生物間特異的細胞壁而組入到完全不同的生物體內(nèi)，定向的控制、修飾和改變生物體的遺傳和變異。人胰島素〔Insulin〕具有多種生物功能，維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。生產(chǎn)方式：一是分別在大腸桿菌中合成A鏈和B鏈，再在體外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。另一種是用分泌型載體表達胰島素原。23整理ppt2人生長激素人生長激素是人的垂體腺前葉嗜酸細胞分泌的一種非糖基化多肽激素。刺激身體生長hGH對一些細胞的增殖和分化以及DNA合成有直接效應(yīng)。干擾素〔Interferon，IFN〕同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及RNA和蛋白質(zhì)的合成。本身不能直接滅活病毒，而是細胞在干擾素作用后產(chǎn)生出多種抗病毒蛋白，從而阻斷病毒的繁殖。24整理ppt分為abt三型根本特性包括種屬特異性、作用廣譜性和選擇性、相對無害性和特殊穩(wěn)定性?？辜毎麅?nèi)侵害微生物活性；抗細胞分裂活性；調(diào)節(jié)免疫功能活性。用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病4白細胞介素白細胞介素是由白細胞或其他體細胞產(chǎn)生的又在白細胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子，是一類重要的免疫調(diào)節(jié)劑。激活并刺激T、B淋巴細胞的增殖和分化刺激巨噬細胞和粒細胞的活性25整理ppt

各種細胞的絲裂原治療惡性腫瘤和病毒性疾病5集落刺激因子是一類能參與造血調(diào)節(jié)過程的糖蛋白分子，又稱造血刺激因子或造血生長因子。分類：粒細胞集落刺激因子巨噬細胞集落刺激因子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子多能集落刺激因子功能：刺激造血細胞增殖、維系細胞存活、分化定型、刺激終末細胞的功能活性臨床多用作癌化療的輔助藥物26整理ppt6促紅細胞生成素腎臟分泌的重要激素與多種貧血尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關(guān)能促進紅細胞系列的增殖、分化及成熟治療慢性腎功能衰竭引起的貧血和治療腫瘤化療后貧血7腫瘤壞死因子除具有抗腫瘤外，還有抗炎活性，促凝血活性，促進細胞因子分泌，免疫調(diào)節(jié)作用，抗病毒、細菌和真菌作用，熱原質(zhì)以及參與骨質(zhì)重吸收淋巴細胞毒素8組織型纖溶酶原激活劑tPA是一種絲氨酸蛋白酶，能激活纖溶酶原生成纖熔酶，纖溶27整理ppt

酶水解血凝塊中的纖維蛋白網(wǎng)，導(dǎo)致血栓溶解。主要用于治療血栓性疾病9心鈉素較強的利鈉、利尿、擴張血管和降低血壓治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫、氣喘10重組乙肝疫苗美、法和德國都已研制出人工合成的前S多肽疫苗，具有很強的免疫原性由化學(xué)合成的HBsAg多肽與破傷風類毒素偶聯(lián)形成復(fù)合蛋白分子制成的疫苗28整理ppt第二節(jié)基因工程制藥中常用的工具酶和克隆載體一常用工具酶1限制酶它們對堿基作用的專一性上及對磷酸二酯鍵的斷裂方式上具有一些獨特的性質(zhì)種類：I型酶II型酶：簡單的單功能酶，作用時無需輔助因子或只需Mg2+，能識別雙鏈DNA上特異的核苷酸序列，底物作用的專一性強，而且其識別序列與切斷序列相一致。限制酶的命名以寄主微生物屬名的第一個字母〔大寫〕和種名的前兩個字母〔小寫〕寫成斜體字的3個字母29整理ppt縮寫，菌株名以非斜體符號加在這三個字母的后面。假設(shè)同一菌株中有幾種不同的限制酶時，那么以羅馬數(shù)字加以區(qū)分。例如HindIII限制酶的特性〔1〕不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列〔2〕各種限制酶的識別序列都具有回文結(jié)構(gòu)雙重旋轉(zhuǎn)對稱排列回文結(jié)構(gòu)即正讀與反讀都相同〔3〕各種限制酶的切割類型是各式各樣的，切后形成各種粘性末端或平整末端30整理ppt錯位切斷DNACohesiveendsFlushends識別序列不同的限制酶，切割后有可能產(chǎn)生相同的粘性末端。同切口限制酶或同裂酶在連接酶的作用下，可以得到嵌合DNA，稱為異源二聚體。來源不同的限制酶，其識別序列可以相同，但其切點位置可不同或相同?！?〕某些限制酶在非標準反響條件下，可能導(dǎo)致酶的識別序列特異性發(fā)生改變在非標準條件下，每種限制酶都有上述嚴格的識別序列導(dǎo)致限制酶的識別序列特異性發(fā)生改變，在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割。稱為限制酶的第2活性，又稱為星活性。31整理ppt

2

DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I〔1〕5’-3’DNA聚合酶活力〔2〕5’-3’外切核酸酶活力降解RNA：DNA雜交體的RNA局部〔3〕3’-5’外切核酸酶活力主要功能是校對所合成的鏈是否能與模板精確無誤地配對在一起。切口平移反響：當雙鏈DNA的一條鏈產(chǎn)生缺口時，DNA聚合酶I將脫氧核苷酸添加到3’羥基末端上，與此同時，其5’-3’外切酶從切口的5’磷酸末端切除原有核苷酸,使切口沿著DNA平移,稱為切口平移反響,又稱為缺口翻譯。以放射性脫氧核苷酸置換原來的脫氧核苷酸標記DNA，從而制作DNA探針。32整理ppt33整理ppt大片段即Klenow片段是用枯草芽孢桿菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I而產(chǎn)生或者通過克隆技術(shù)而得到的單一多肽鏈。全酶中去除了5’-3’外切核酸酶活力，而聚合酶活力及3’-5’外切核酸酶活力均不受影響。補平限制酶切割DNA后產(chǎn)生的3’凹端用[32P]dNTP補平3’凹端，對DNA片段進行末端標記在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二鏈應(yīng)用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進行DNA測序

T4噬菌體DNA聚合酶與Klenow片段相似的是都具有5’-3’聚合酶活力及3’-5’外切核酸酶活力，而且3’-5‘外切酶活力對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA更強。34整理ppt經(jīng)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶更強的3’-5’外切核酸酶活力DNA平均長度比其他聚合酶大得多拷貝長段模板測序酶，測序酶〔2.0版〕完全喪失了核酸外切酶活力TaqDNA聚合酶及AmpliTaqTMDNA聚合酶水生棲熱菌具有5’-3‘聚合酶活力和依賴于聚合作用的5‘-3’外切核酸酶活力。最正確作用溫度為75-80。C，為防止引物自模板上解離往往需在低于最適溫度條件下起始聚合反響。聚合酶鏈式反響35整理ppt反轉(zhuǎn)錄酶鼠或禽反轉(zhuǎn)錄病毒

H活力主要用于將mRNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，也可用于制備雜交用探針和標記帶5’突出端的DNA片段。DNA連接酶能將兩段DNA拼接起來的酶叫DNA連接酶。T4噬菌體DNA聚合酶連接帶有匹配粘性末端的雙鏈DNA連接平整末端的雙鏈DNA36整理ppt大腸桿菌DNA連接酶需NAD輔助因子基因工程中常用的其他酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶〔簡稱末端轉(zhuǎn)移酶或TDT酶〕作用底物是帶3’羥基端的單鏈DNA或帶3’羥基突出端的雙鏈DNA。主要用于給載體或cDNA加上互補的同聚尾以及用32P標記的一種dNTP來標記DNA片段的3’端。T4噬菌體多核苷酸激酶它能催化ATP的-磷酸基轉(zhuǎn)移至去磷酸化的DNA或RNA的5’末端該酶可用于標記DNA5’末端37整理ppt核酸酶BLA31核酸酶主要活力是3’外切核酸酶活力，DNA內(nèi)切酶活力反響絕對依賴于鈣離子〔1〕通過可控方式去除雙鏈DNA的末端核苷酸從而縮短DNA分子〔2〕用于確定DNA小片段的限制酶切圖S1核酸酶單鏈特異性的內(nèi)切酶可降解單鏈DNA或RNA〔1〕去除DNA片段中突出的單鏈尾部〔2〕翻開從mRNA合成雙鏈cDNA時產(chǎn)生的‘發(fā)夾環(huán)’

38整理ppt堿性磷酸酯酶細菌堿性磷酸酯酶〔BAP〕和牛小腸堿性磷酸酯酶〔CIP〕兩種催化去除單鏈或雙鏈DNA和RNA分子中的5’-磷酸基〔脫磷酸作用〕去除切割載體DNA兩端的5’-磷酸基，防止自身環(huán)化二常用的克隆載體具有在細胞內(nèi)進行自我復(fù)制的DNA子就是外源DNA片段〔基因〕的運載體，又可稱為分子載體或無性繁殖載體。有了復(fù)制子作為外源DNA的載體質(zhì)粒質(zhì)?！睵lasmid〕是一些存在于微生物細胞內(nèi)染色體外的閉合環(huán)狀雙鏈的小型DNA分子。39整理ppt質(zhì)粒載體的改造和構(gòu)建特性〔1〕要有復(fù)制子〔2〕要有能促進外源DNA高水平表達的調(diào)控區(qū)，如含有強啟動子〔3〕要有多種限制酶的單一切點〔4〕具有兩種以上易被檢測的選擇性遺傳標記，作為對重組與非重組轉(zhuǎn)化體的選擇標記〔最好有一個具有插入性失活功能〕?！?〕質(zhì)粒載體DNA的分子量要盡可能小，以利于載體容納較長區(qū)段外源DNA片段?！?〕應(yīng)屬于松弛型復(fù)制〔7〕質(zhì)粒載體應(yīng)為非傳遞性，有較小的宿主范圍，不為傳遞性載體所誘導(dǎo)。40整理ppt階段〔1〕將選擇標記引入含有pMBI或ColE1復(fù)制子的質(zhì)粒中pBR322僅4.36kb〔2〕調(diào)整質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)，提高質(zhì)粒載體的效率新型載體都引入一個人工合成的由多種常用限制酶單一識別序列組成的多克隆位點或多聚接頭。〔3〕引入多種用途的輔助序列，構(gòu)建具有某些特化功能的質(zhì)粒載體構(gòu)建可用組織化學(xué)方法鑒定重組克隆的質(zhì)粒載體如pUC載體帶有一個Lac操縱子的DNA片段，該區(qū)段編碼b-半乳糖苷酶氨基端的一個片段，該片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型b-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補。外源DNA插入載體的多克隆位點后，可使酶的氨基端片段失活而破壞這種互補作用，導(dǎo)致帶有重組質(zhì)粒的細菌在含有誘導(dǎo)物IPTG和生色底物X-gal培養(yǎng)基上產(chǎn)生白色菌落，從而可用肉眼鑒定重組克隆。41整理ppt構(gòu)建帶有單鏈噬菌體復(fù)制起點的質(zhì)粒載體可大量獲得載體DNA雙鏈中的一條鏈構(gòu)建帶有噬菌體啟動子的質(zhì)粒載體體外得以轉(zhuǎn)錄RNA而翻譯構(gòu)建可對重組克隆進行正選擇的質(zhì)粒載體某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物構(gòu)建含有強啟動子的質(zhì)粒載體常用的幾種質(zhì)粒載體〔1〕pBR322及其衍生載體非必需區(qū)域，分子量相對較大，能被Colk帶動轉(zhuǎn)移有關(guān)轉(zhuǎn)移的mob區(qū)段剛好在非必需區(qū)域內(nèi)42整理ppt43整理pptpAT153載體之間缺失2個片段包含結(jié)合轉(zhuǎn)移的有關(guān)序列pBR327載體〔2〕pUC系列載體pUC18、pUC19質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒缺乏與控制拷貝數(shù)有關(guān)的rop基因，故這些質(zhì)粒復(fù)制的拷貝數(shù)要比帶有pMB1或ColE1復(fù)制起點的質(zhì)粒高得多。PUC118、pUC119質(zhì)粒載體帶有M13絲狀噬菌體DNA合成的起始、終止及DNA包裝進入噬菌體顆粒所必需的序列。44整理ppt45整理ppt這些質(zhì)粒的宿主細胞被適當?shù)慕z狀噬菌體感染時，可合成質(zhì)粒DNA中一條鏈，并能將此單鏈DNA包裝進入子代噬菌體。pUC的衍生質(zhì)粒載體噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄單位的啟動子噬菌體噬菌體載體的構(gòu)建噬菌體基因組為雙鏈線狀DNA感染時，DNA的兩末端配對并由連接酶的作用閉合成環(huán)狀〔1〕A至J區(qū)段：分布在基因組左臂，約占1/3基因組。噬菌體頭部〔A-F〕、尾部〔Z-J〕〔2〕J至N之間非必需區(qū)段：約占1/3基因組控制重組及溶源性的基因，可被消除和取代46整理ppt47整理ppt〔3〕N至R區(qū)段：分布在基因組右臂，與噬菌斑的形成有關(guān)。包括調(diào)控及免疫性基因、DNA復(fù)制基因、轉(zhuǎn)錄和裂解基因等。消除多余限制性內(nèi)切酶位點消除基因組必需區(qū)內(nèi)的酶切位點，保存非必需區(qū)內(nèi)1-2個位點方法：點突變、基因組的置換和缺失去除DNA中一些非必需區(qū)段有75%-105%38-52kbDNA才能被包裝成噬菌體顆粒插入型載體DNA基因組中缺失局部非必需基因，只含有一個可供外源DNA插入的限制性內(nèi)切酶位點的DNA載體。48整理ppt替換型載體在DNA的可替換片段兩端具有兩個限制性內(nèi)切酶位點，酶切后替換片段與帶有所有必需基因的左右雙臂分開，有外源DNA代之。攜帶外源DNA的重組體的正選擇標記。提高載體在生物學(xué)防護上的平安性，引入了WES三個基因的琥珀突變，這些特性使從實驗室環(huán)境中逃逸出重組噬菌體的可能性大大降低。Charon16A載體的基因A和B上誘變產(chǎn)生了琥珀突變。結(jié)果在含有色原底物Xgal和Lac-指示菌的平板培養(yǎng)基上形成無色的噬菌斑。常用載體〔1〕Charon系列載體Charon40載體是專門設(shè)計用來容納大片段49整理ppt〔2〕EMBL系列載體EMBL3、EMBL4對稱的兩個多酶位點聚合接頭序列EMBL3A帶有兩個琥珀突變，可篩選出SUPF〔琥珀抑制基因〕相聯(lián)的DNA序列。構(gòu)建基因文庫〔3〕gt系列載體為插入型系列載體，包括gt10、pgt11、gt18-23等gt10：專門為在其免疫區(qū)〔imm434？〕內(nèi)單一的EcoRI位點上克隆小的cDNA片段〔約6kb〕而設(shè)計的。阻遏子基因CI，CI基因失活形成了重組的CI-噬菌體，噬菌斑為清亮斑，可與非重組的CI-噬菌體所產(chǎn)生的陰暗噬菌斑相區(qū)別。50整理ppt51整理ppt52整理pptgt11：是一個常用的，可用于免疫學(xué)篩選的載體。如果插入的DNA片段方向正確且轉(zhuǎn)譯讀框與LacZ基因一致，那么重組噬菌體能在宿主菌內(nèi)指導(dǎo)b-半乳糖苷酶。含有對溫度敏感的阻遏子〔43。失活〕，可作為抗溶源性生長的選擇性。M13噬菌體M13噬菌體的根本特性基因組為環(huán)狀單鏈DNA分子雄性專一性，即只吸附于帶有F質(zhì)粒的雄性大腸桿菌〔F+〕的性纖毛上而引起感染。轉(zhuǎn)換成雙鏈復(fù)制型〔RF〕在基因3產(chǎn)物的作用下，以單鏈DNA為模板，先從一個RNA引物開始，通過宿主DNA聚合酶III延伸，合成雙鏈DNA〔RFDNA〕。然后在基因2

53整理ppt產(chǎn)物作用下RFDNA進行復(fù)制，每個細胞可產(chǎn)生50-100RFDNA拷貝。由基因5產(chǎn)生的M13單鏈結(jié)合蛋白與通過滾環(huán)復(fù)制合成的DNA單鏈結(jié)合并進行包裝形成子代噬菌體。通過細胞壁擠出，并不殺死細胞細胞生長速率降低，并不斷釋放子代噬菌體繼續(xù)感染周圍細胞在平板上不形成空斑，形成緩慢生長的慢性感染細胞圈

M13絲狀噬菌體載體的構(gòu)建將含有大腸桿菌乳糖操縱子調(diào)節(jié)區(qū)段和編碼b-半乳糖苷酶基因的頭145個密碼插入這個區(qū)的酶切位點，得M13mp1，可被轉(zhuǎn)譯為多肽。多肽雖然沒有酶活力，但當M13mp1感染特殊的宿主菌JM103時，會導(dǎo)致多互補而產(chǎn)生有活性的b-半乳糖苷酶，在含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上形成藍色噬菌斑。這兩個載體對于具有兩個不同酶切位點末端的外源DNA片段，可通過強制克隆而定向連接。54整理ppt常用的M13噬菌體載體M13mp18、M13mp19LacZ區(qū)內(nèi)的多克隆位點中都含有13個不同的酶切位點兩個載體不會輕易自身再環(huán)化外源DNA在M13mp18、M13mp19中以兩個互為相反的方向插入pBR322質(zhì)粒載體的復(fù)制起點〔Ori〕和氨芐青霉素抗性基因〔Ampr〕粘粒粘粒是一種有噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由DNAcos區(qū)與質(zhì)粒DNA重組構(gòu)建而成。是為克隆和增殖基因組DNA的大片段而設(shè)計的和組建真核生物基因文庫最大DNA可達52kb，粘粒大小為4-7kb，適宜35-45kbcosDNA序列〔將DNA包裝到噬菌體顆粒中所必需的序列〕，攜有一個復(fù)55整理ppt制起點〔通常是ColE1復(fù)制起點〕和一個抗藥性標記〔通常是Ampr〕。將兩個cos位點組合到同一個粘粒載體中，從而大大簡化在粘粒載體中的定向克隆。哺乳動物細胞載體系統(tǒng)一類是不帶真核復(fù)制子的質(zhì)粒型載體，是在原核質(zhì)粒中插入一個完整的哺乳動物細胞轉(zhuǎn)錄單位和一個選擇標記基因而組成的簡單載體系統(tǒng)。如pTK2、pHyg、pRSVneo另一類是帶有真核病毒調(diào)控序列元件的質(zhì)粒表達載體。

56整理ppt第三節(jié)基因工程藥物無性繁殖系的組建目的基因的制取構(gòu)建基因文庫法別離目的基因1用一種或兩種限制酶消化噬菌體替換型載體，選用適當方法將載體左、右臂與中間部位的填充片段別離開。2用一種或幾種限制酶局部消化高分子量的真核基因組DNA，再用凝膠電泳或密度梯度離心法別離出適宜長度的DNA。3噬菌體載體臂與真核DNA片段連接成較長的多聯(lián)體，再利用體外包裝系統(tǒng)裝入噬菌體頭部，成為有感染力的噬菌體。4重組噬菌體通過在大腸桿菌中生長而得以繁殖，所獲得的基因組DNA文庫可被長時間利用和貯存酶促合成法制取目的基因平均每個細胞約含10-5g總RNA57整理ppt58整理pptMrna總RNA的1%-5%從某些特定型別的分化細胞細胞質(zhì)中，編碼某特種蛋白質(zhì)的目mRNA占總mRNA的50%-90%，稱為高豐度mRNA。低豐度mRNA或稀有mRNA真核細胞的mRNA分子在其3’端均有一多聚腺苷酸[poly〔A〕，20-250個]殘基組成的尾，可吸附于寡脫氧胸苷酸-[Oligo〔dT〕]纖維素。構(gòu)建cDNA文庫PT-PCR法從構(gòu)建的cDNA文庫中篩選目的cDNA〔1〕真核細胞總RNA的別離釋放的內(nèi)源性RNA酶〔Rnase〕的活力外源性Rnase對RNA制品的污染59整理ppt60整理ppt硫氰酸胍提取和氯化銫離心法鹽酸胍和有機溶劑提取法〔2〕帶poly〔A〕的RNA-mRNA的別離純化與分析常用Northern雜交〔RNA印跡法〕測定總RNA或poly〔A〕RNA樣品中特定mRNA分子的大小和豐度。〔3〕cDNA文庫的構(gòu)建cDNA第一鏈的酶促合成禽源和鼠源反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)法：雜交體變性而分開后，單鏈cDNA端能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而引導(dǎo)E.coliDNA聚合酶IKlenow片段酶促合成cDNA第一鏈。置換合成法：利用cDNA：mRNA雜交體為切口平移的模板，由RNA酶H在mRNA鏈上造成切口和缺口而產(chǎn)生一系列RNA引物，再由DNA聚61整理ppt合酶I用這些引物以切口平移反響合成cDNA第二鏈。雙鏈cDNA載體DNA的連接噬菌體體外包裝及感染構(gòu)建cDNA文庫目的cDNA克隆的篩選核酸雜交法特異性抗原的免疫學(xué)檢測法cDNA克隆的同胞選擇法RT-PCR法合成目的cDNA反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反響從真核生物細胞中提取純化總RNA在Oligo(dT)的引導(dǎo)下,以總RNA中的總mRNA為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成總cDNA的第一鏈62整理ppt63整理ppt以兩個引物所結(jié)合的單鏈cDNA(靶序列)為模板,在Taq聚合酶的作用下進行PCR擴增,合成雙鏈目的cDNA(1)聚合酶鏈式反響〔PCR〕體外擴增DNA技術(shù)Polymerasechainreaction應(yīng)用該技術(shù)可在很短的時間內(nèi)得到數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝宏觀與微觀的聯(lián)系PCR技術(shù)的根本原理：首先使雙鏈DNA在反響液中熱變性而分開成單鏈，然后在低溫下與兩個引物進行退火，使引物與單鏈DNA配對結(jié)合，再在中溫下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及熱穩(wěn)定性進行聚合〔延伸〕反響。每經(jīng)過一次變性、退火、延伸三個步驟為一個循環(huán)，通過三個溫度的不同循環(huán)。

64整理pptPCR反響體系的組成a.含靶序列的DNA需用0.2-2g基因組DNAb.寡核苷酸〔引物〕20-24個核苷酸1mol/L盡量選擇堿基隨機分布的序列GC含量盡可能接近50%防止因較長的互補序列而形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)使其5’端帶一罕有的限制酶序列，使擴增產(chǎn)物既含有目標序列，兩側(cè)又帶有限制酶切位點。TaqDNA聚合酶工程酶〔AmpliTaqTM〕酶量為1-5u65整理pptd.四種dNTP50-200mol/LPCR緩沖液10mmol/LTrisHCl〔pH8.3，于室溫〕1.5mmol/LMgCl2Mg2+為1.5mmol/LPCR體外擴增DNA操作過程PCR自動擴增儀〔2〕PCR擴增由mRNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA‘上游’寡核苷酸引物‘下游’寡核苷酸引物66整理ppt67整理pptDNA體外重組是將目的基因〔外源DNA片段〕用DNA連接酶在體外連接到適宜的載體DNA上，這種重新組合的DNA稱為重組DNA，簡稱重組體。目的基因DNA與質(zhì)粒載體DNA的連接定向克隆法當用兩種不同的限制酶〔如用BamHI和HindIII〕消化外源DNA時，可以產(chǎn)生帶有非互補突出末端的外源DNA片段。排阻凝膠層析以便與切下來的小片段分開防止使用在多克隆位點上彼此直接相鄰的限制酶切位點粘性末端連接法質(zhì)粒載體和外源DNA都可能發(fā)生自身環(huán)化或形成串聯(lián)寡聚物用堿性磷酸酶去除線狀載體DNA兩端的5’磷酸基團以盡量減少載目的基因與克隆載體的體外重組68整理ppt體DNA的自身環(huán)化或連接。經(jīng)去磷酸化的載體DNA仍然可有效的與具有5’末端磷酸的外源DNA相連接，產(chǎn)生含有兩個切口的環(huán)狀重組DNA分子，可直接轉(zhuǎn)化并由宿主菌修復(fù)切口。這種帶切口的環(huán)狀DNA的轉(zhuǎn)化效率比線狀DNA高得多應(yīng)含有足量的載體DNA平端連接法平整末端連接屬于低效反響極高濃度的T4噬菌體DNA連接酶高濃度的平整末端外源DNA和質(zhì)粒DNA低濃度〔0.5mmol/L〕的ATP不存在亞精胺一類的多胺69整理ppt適量的凝聚劑快速克隆法需從純化的凝膠中回收含目的條帶的瓊脂糖塊，熔化后直接進行質(zhì)粒載體和外源DNA的連接。同聚物加尾法末端轉(zhuǎn)移酶可催化dNTP加到單鏈或雙鏈DNA3’羥基端的能力，在目的DNA和質(zhì)粒載體上參加互補同聚物，兩者在通過互補同聚物之間氫鍵形成可轉(zhuǎn)化大腸桿菌的開環(huán)重組分子。采用GC加尾，即將dC殘基加到雙鏈cDNA上，而將互補的dG殘基加到用PstI消化的質(zhì)粒載體上。加合成接頭或銜接頭法70整理ppt合成接頭是化學(xué)合成的兩個自相互補的核苷酸寡聚體〔8-12bp〕而兩個寡聚體可形成帶一個或一個以上限制酶切位點的平整末端雙鏈體。第一次反響是使平整末端的雙鏈接頭與平整末端的目的DNA相連第二次連接反響那么是將加上接頭的目的DNA片段與帶有匹配粘性末端的載體DNA相連接。銜接頭與接頭不同，它是一小段帶有一個平整末端〔與雙鏈DNA連接〕和一個粘性末端〔與載體的相應(yīng)末端連接〕的雙鏈寡核苷酸。其他轉(zhuǎn)換末端形式連接法〔1〕局部補平3’凹端〔2〕完全補平3’凹端〔3〕除3’突出端71整理ppt目的基因DNA與噬菌體載體DNA的連接〔1〕用于構(gòu)建真核基因組DNA文庫〔2〕用于構(gòu)建復(fù)雜的cDNA文庫〔3〕用于亞克隆在粘性載體中增殖的外源目的DNA序列噬菌體載體臂DNA的制備酶切后將填充片段從載體臂中除去用堿性磷酸酶處理酶切載體片段用雙酶切割載體〔1〕常用蔗糖或氯化鈉密度梯度離心法，也有用0.5%瓊脂糖凝膠制備電泳純化載體臂?！?〕用堿性磷酸酶處理噬菌體臂72整理ppt末端的5’磷酸基團這樣能夠有效的防止自身環(huán)化。并降低載體左右臂連接以后所形成的非重組載體的數(shù)目。用堿性磷酸酶處理之前一定要使噬菌體臂的粘性末端退火并連接，否那么將抑制噬菌體多聯(lián)體的形成，使下一步的包裝效率大大降低?！?〕用雙酶消化噬菌體載體噬菌體載體臂與外源目的DNA片段的連接一個是載體臂與外源DNA片段的比例另一個是這兩種DNA片段在連接反響混合液中的濃度一般都必須進行連接預(yù)試驗，以檢查其效率73整理ppt以微生物〔主要有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌〕受體細胞是指在轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)〔感染〕中接受外源基因的宿主細胞〔1〕成感受態(tài)細胞〔2〕應(yīng)為限制酶缺陷型〔3〕一般應(yīng)為DNA重組缺陷型〔4〕不適于在人體內(nèi)或在非培養(yǎng)條件下生存〔5〕它的DNA不易轉(zhuǎn)移，重組載體DNA只在宿主中復(fù)制大腸桿菌K12的突變型HB101和C600等作為當前重組DNA的主要受體菌。把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA引入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化。將重組噬菌體DNA直接引入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。重組克隆載體引入宿主細胞的轉(zhuǎn)化與感染74整理ppt重組噬菌體DNA被包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為運載體，這一過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，通常稱為感染。重組質(zhì)粒DNA引入大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化感受態(tài)：細菌吸收轉(zhuǎn)化因子〔DNA〕的生理狀態(tài)，細菌在體溫下經(jīng)CaCl2溶液處理，再做短暫加熱后，會使受體細菌中誘導(dǎo)產(chǎn)生出一種短暫的感受態(tài)。在此期間他們能夠攝取各種不同來源的DNA原生質(zhì)體化假說和酶受體假說用氯化鈣制備新鮮感受態(tài)細胞及重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化存于-70C，貯存時間過長會在一定程度上影響轉(zhuǎn)化效率75整理ppt用復(fù)合劑制備新鮮或冷凍的感受態(tài)細胞及重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化二價陽離子〔MnCl2和CaCl2〕中更長時間，并且用氯化六氨合高鈷、DMSO、DTT〔二硫蘇糖醇〕等試劑復(fù)合處理細菌可提高轉(zhuǎn)化效率。高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法〔電轉(zhuǎn)化法〕重組噬菌體DNA的體外包裝與感染用噬菌體突變株〔參與包裝的基因發(fā)生突變〕感染適當細菌，再從感染細菌中制備包裝提取物。用此提取物對完整的噬菌體DNA進行體外包裝。包裝提取物的制備〔1〕用兩個不同的溶源性菌株制備包裝提取物BHB2690菌株，用超聲破碎法處理制備含前頭部的包裝提取物BHB2668菌株，用凍融裂菌法處理，制備含D蛋白和其他必需成分的包裝提取物。76整理ppt大腸桿菌C菌株的非抑制性溶源菌SMR10內(nèi)源性噬菌體DNA的COS位點缺失，不能被A蛋白識別因而不能插入前頭部內(nèi)，而帶有COS位點的外源DNA那么可被A蛋白識別并被插入前頭部，包裝過程可繼續(xù)進行，產(chǎn)生感染性噬菌體顆粒。大腸桿菌C菌株缺少EcoK限制系統(tǒng)，在包裝過程中使含有未經(jīng)修飾的EcoK識別位點的外源DNA免受限制系統(tǒng)作用。重組噬菌體DNA的體外包裝與感染〔1〕用兩種不同的提取物進行體外包裝和感染〔2〕用一種提取物進行體外包裝和感染重組克隆載體導(dǎo)入哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染利用Polybrene的DNA轉(zhuǎn)染利用原生質(zhì)體融合的DNA轉(zhuǎn)染〔2〕只用一個溶源性菌株制備包裝提取物77整理ppt電穿孔法DNA轉(zhuǎn)染受體細胞的型別、不同的培養(yǎng)細胞系、其攝取和表達外源DNA的能力相差達幾個數(shù)量級?！?〕磷酸鈣和DNA共沉淀物轉(zhuǎn)染法重組載體以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)，培養(yǎng)細胞攝取DNA的能力將顯著提高。最正確鈣離子濃度為125mmol/L，最正確DNA濃度為5-30g/ml沉淀反響最正確時間為20-30min細胞在沉淀物中的最正確暴露時間為5-42h〔2〕DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法這一聚合物可能與DNA結(jié)合從而抑制核酸酶的作用，或者與細胞結(jié)合從而促進DNA的內(nèi)吞作用78整理pptDEAE-葡聚糖的濃度及細胞暴露于DNA/DEAE-葡聚糖混合液的時間是兩個大大影響本法效率的重要參數(shù)?！?〕利用Polybrene的DNA轉(zhuǎn)染法〔4〕利用原生質(zhì)體融合的DNA轉(zhuǎn)染法用于克隆化目的基因的瞬時表達用于建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞系轉(zhuǎn)染效率較高〔5〕電穿孔法DNA轉(zhuǎn)染受外加電場強度、電泳沖長度、溫度、DNA的構(gòu)象和濃度、培養(yǎng)液的離子成分的影響。79整理ppt含目的基因重組的篩選、鑒定與分析重組體〔菌〕的篩選抗生素抗性基因插入失活法用某種限制酶消化并在此位點插入外源目的DNA時，抗藥性基因不在被表達，稱為基因插入失活。b-半乳糖苷酶基因插入失活法放射性標記核酸探針雜交篩選法優(yōu)點：具有高度的特異性和敏感性它不要求插入的外源基因表達先在一種固體支持膜〔如硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman541濾紙〕上原位裂解待篩選的細菌菌落并使釋放出的DNA固定于膜上，然后在溶液中與放射性標記的核酸探針雜交，從而很容易的同時篩選大量菌落，從中找出帶有含目的基因重組質(zhì)粒的菌落。〔1〕切口平移法80整理ppt〔2〕引物延伸法純化的DNA與過量的隨機引物相混合，煮沸變性，然后用E。coliDNA聚合酶I的Klenow片段進行合成〔3〕體外轉(zhuǎn)錄合成RNA探針一種是合成可與克隆于M13噬菌體載體上的序列互補的單鏈DNA探針另一種是將克隆于特定載體的靶序列轉(zhuǎn)錄成RNA探針只需要不含RNA酶的DNA酶I便可容易的除去DNA模板RNA探針與DNA和RNA形成的雜交體更穩(wěn)定也不會被Rnase消化，可用該酶除去非特異結(jié)合的探針?！?〕cDNA探針的合成一種是用Oligo〔dT〕做引物另一種那么采用隨機引物81整理ppt某一特定序列的濃度得以提高?！?〕合成寡核苷酸探針將菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移或影印到硝酸纖維素濾膜上裂解菌落或噬菌體并使釋放的DNA原位結(jié)合與濾膜上扣除雜交的方法，制取單鏈標記cDNA吸收探針，使cDNA探針中固定于濾膜上的細菌DNA或噬菌體DNA與標記探針進行雜交免疫化學(xué)篩選法該法的特點是直接檢測克隆基因所表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，故應(yīng)用該法時必須事先制備針對該蛋白質(zhì)或多肽的抗血清或單克隆抗體，而最正確抗體應(yīng)當是與目的蛋白〔抗原〕不同表位反響的一組單克隆抗體混合物，或者是不與宿主成分反響的高滴度多克隆抗體。82整理ppt放射化學(xué)檢測制劑可用抗第一抗體種特異性決定簇的125I標記抗抗體或125I標記金黃色葡萄球菌A蛋白。酶法檢測制劑可用與辣根過氧化物酶〔HRP〕綴合的第二抗體或與堿性磷酸酶〔AP〕綴合的第二抗體形成不溶性有色沉淀。重組體的鑒定凝膠電泳鑒定法標準方法直接用溴化乙錠進行染色以確定DNA在凝膠中的位置，并直接與紫外燈下觀察DNA條帶。應(yīng)有兩條帶：一條是泳動速度較慢分子量較大的帶〔相當于質(zhì)粒載體DNA〕另一條是泳動速度較快分子量較小的帶〔相當于目的基因DNA片段〕83整理ppt平板裂解物法和液體培養(yǎng)法Southern轉(zhuǎn)移雜交法〔1〕瓊脂糖凝膠電泳別離重組DNA的限制酶切片段〔2〕將DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持體上硝酸纖維素濾膜或尼龍膜毛細管轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法〔3〕放射性標記探針與固著于膜上的DNA雜交基因產(chǎn)物鑒定法常用體外轉(zhuǎn)譯法對基因產(chǎn)物進行鑒定。從細胞中提取的天然mRNA或通過克隆化的DNA在體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，在無細胞提取液中能被翻譯而合成蛋白質(zhì)，這些體外翻譯反響產(chǎn)物可通過免疫沉淀或SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳加以分析鑒定，對原核生物的基因產(chǎn)物進行鑒定，常用大腸桿菌或枯草芽84整理ppt胞苷菌無細胞系統(tǒng)，而對真核生物基因產(chǎn)物常用兔網(wǎng)織紅細胞裂解液或麥胚提取物重組DNA的序列分析一種是Sanger雙脫氧鏈終止法〔酶法〕測序另一種是Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法測序1Sanger雙脫氧鏈終止法DNA測序的主要試劑〔1〕模板〔2〕通用引物〔3〕DNA聚合酶I的Klenow段、反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、測序酶、測序酶2.0版〔4〕采用[32S]dATP〔5〕采用諸如dITP或7-脫氮-dGTP85整理pptSanger雙脫氧鏈終止法測序過程一是退火反響，即寡核苷酸引物與模板DNA雜交二是4組鏈延伸-鏈終止反響96孔U形孔微量滴定板中進行測序儀：PE公司推出的ABIPRISM310型全自動DNA測序儀310型測序儀采用毛細管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠平板電泳進行DNA測序分析，不僅具有DNA測序、PCR片段大小分析和定量分析功能，而且實現(xiàn)了全部操作自動化，包括自動灌膠、自動進樣、自動數(shù)據(jù)收集分析。377型測序儀采用四種熒光染料標記、激光檢測的方法。86整理ppt

五目的基因在宿主細胞中的表達基因表達在原核生物和真核生物中是有區(qū)別的，在原核生物中基因表達是以操縱子形式進行，磚錄是在核內(nèi)進行，先生成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，修飾5’和3’末端才形成mRNA。而mRNA只能在細胞漿的核糖體中轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)加工、糖化、形成高級結(jié)構(gòu)。原核細胞〔主要是大腸桿菌〕真核細胞表達體系，如酵母與哺乳動物細胞系目的基因在原核細胞中的表達在大腸桿菌中表達合成完整天然蛋白在細菌中表達原核蛋白時，首先必須選擇帶有可調(diào)控的強原核啟動子的表達載體。噬菌體PL啟動子、tac啟動子和T7噬菌體10啟動子從外部同時提供啟動子和有效的核糖體結(jié)合位點87整理ppt起始密碼子〔ATG〕和Shine-D-algarno序列，后者簡稱SD序列mRNA上的SD序列與16SrRNA上的3’端序列之間形成堿基配對，由此帶動核糖體與mRNA的結(jié)合。一種是可使克隆化目的基因表達為融合蛋白的一局部融合蛋白由位于其氨基端的原核蛋白、能被蛋白酶或溴化氰裂解的序列以及目的蛋白三局部組成。融合蛋白通常較穩(wěn)定，易于鑒定并可用作抗原，也可產(chǎn)生不含氨基端甲硫氨酸的蛋白高效表達由雙分子胰島素原組成另一種是外源蛋白的分泌型表達系統(tǒng)融合到編碼信號肽的DNA中而實現(xiàn)的可使蛋白質(zhì)按適當方式折疊通常產(chǎn)量不高88整理ppt克隆化目的基因表達水平的提高與檢測RNA不穩(wěn)定、過早終止、無效翻譯及蛋白質(zhì)不穩(wěn)定蛋白質(zhì)缺陷型菌株在培養(yǎng)和收獲細胞期間使用蛋白酶抑制劑通過提高目的蛋白的合成量加以克服〔1〕運用定點誘變技術(shù)使核糖體結(jié)合位點〔SD序列和起始密碼子ATG〕周圍的堿基對發(fā)生突變?！?〕試用不同表達水平的大腸桿菌宿主菌株，如利用轉(zhuǎn)錄終止缺陷型菌株或RNA代謝突變株，可提高功能性RNA的合成量?！?〕在目的基因DNA的下游裝置一段DNA序列〔4〕通過改變溫度、核糖體結(jié)合位點、啟動子強度、質(zhì)?？截悢?shù)或誘導(dǎo)物的量。89整理ppt目的基因在真核細胞中的表達原核細胞對真核生物活性蛋白不能進行有效的翻譯后加工包括二硫鍵形成、糖基化、磷酸化、寡聚體形成、特異性蛋白裂解真核蛋白比活力都很低，與蛋白質(zhì)的折疊方式不正確或折疊效率低有關(guān)真核細胞〔如哺乳動物細胞〕表達系統(tǒng)可以分為兩類：一類是采用病毒載體的表達系統(tǒng)另一類是轉(zhuǎn)染DNA的表達系統(tǒng)克隆化的目的基因必須插入適當?shù)谋磉_載體并在細菌中克隆和復(fù)制擴增后才轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞。用于在哺乳動物細胞中導(dǎo)入和表達克隆化目的基因的質(zhì)粒載體經(jīng)過改造后既帶有與待表達基因序列5’端和3’端相匹配的限制酶切位點，又帶有具備所需特異性的調(diào)控序列元件。復(fù)制子、抗生素抗性基因、單一限制酶切位點90整理ppt〔1〕啟動子與增強子根據(jù)用于表達重組基因的細胞型別來決定TATA25-30bp引導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點上起始RNA的合成100-200bp決定轉(zhuǎn)錄起始的速率SV40早期基因增強子〔2〕加poly〔A〕信號一種是位于poly〔A〕位點下游的GU豐富區(qū)或U豐富區(qū)另一種是位于poly〔A〕位點上游11-30個核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA?！?〕剪接信號在一級轉(zhuǎn)錄物上加上poly〔A〕后通過剪接除去內(nèi)含子并產(chǎn)生成熟的mRNA，然后在從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。91整理ppt內(nèi)含子最前面〔GU〕和最后面〔AG〕的兩個核苷酸總是保持不變剪接點之間的距離和周圍的DNA序列，包括剪接點側(cè)翼的外顯子序列的改變，顯著影響mRNA前體的剪接歷程和剪接點的使用效率?！?〕用于復(fù)制和選擇的元件病毒復(fù)制子表達轉(zhuǎn)染目的基因的重組細胞必須通過在同一細胞中引入另一種選擇標記基因才能得以識別別離。將編碼目的蛋白的目的基因〔在一個質(zhì)粒上〕和編碼選擇標記蛋白的基因用共轉(zhuǎn)染方法同時導(dǎo)入哺乳動物細胞。92整理ppt

六基因工程藥物無性繁殖系的組建實例人胰島素原融合蛋白重組菌株的組建重組表達質(zhì)粒pJG202的構(gòu)建與鑒定重組質(zhì)粒pJG202在大腸桿菌中的表達人a2b型干擾素〔hIFN-a2b〕工程菌株的組建雙SD順序hIFN-a2b基因的獲得重組表達質(zhì)粒pMZI2B的構(gòu)建人a2b型干擾素工程菌株的形成與基因的表達粒細胞巨噬細胞集落刺激因子工程菌株的組建RT-PCR法制備GM-CSFcDNAGM-CSF重組表達載體與工程菌株的組建93整理ppt94整理ppt95整理ppt96整理ppt乙型肝炎外表抗原重組酵母的組建HBsAg基因重組表達質(zhì)粒pLS1和pLS2的構(gòu)建這個質(zhì)粒在乳酸克魯維酵母及大腸桿菌中都能復(fù)制XbaISalI插入片段的方向通過電泳檢查XbaI和SalI雙酶切片段的大小來確定2重組表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及HBsAg的表達人組織型纖溶酶原激活劑組合突變株CHO細胞株的組建真核表達質(zhì)粒pLFrGGI的構(gòu)建FrGGISV40EAdMLPSV40P采用二氫葉酸復(fù)原酶的競爭性抑制劑氨甲喋呤(MTX)選擇加壓共擴增外源基因。2高效表達FrGGI〔tPA突變體〕的CHO細胞株的獲得97整理ppt98整理ppt99整理ppt紅細胞生成素中國倉鼠卵巢細胞株的組建質(zhì)粒與細胞株EPO真核重組表達質(zhì)粒pMGL4的構(gòu)建重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞及產(chǎn)物表達重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞及EPO表達氨甲喋呤〔MTX〕可以控制人腫瘤壞死因子昆蟲細胞株的組建含hTNF-a基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建共轉(zhuǎn)染與重組病毒的獲得重組病毒感染Sf21細胞及hTNF-a的表達100整理ppt101整理ppt

第四節(jié)基因工程藥物的生產(chǎn)基因工程菌株〔細胞〕的培養(yǎng)與發(fā)酵宿主、載體和克隆基因環(huán)境條件工程細菌的培養(yǎng)與發(fā)酵〔1〕發(fā)酵用工程菌株的篩選〔2〕發(fā)酵培養(yǎng)基的選用〔3〕接種量對發(fā)酵的影響〔4〕溶解氧〔DO〕水平對發(fā)酵的影響〔5〕pH對工程菌株生長和表達的影響前期培養(yǎng)階段著重于優(yōu)化工程菌株的最正確生長條件后期培養(yǎng)階段著重于優(yōu)化外源蛋白的表達條件102整理ppt〔6〕熱誘導(dǎo)時機對產(chǎn)物表達量的影響一般在菌體對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期進行生溫誘導(dǎo)表達分批發(fā)酵培養(yǎng)〔7〕熱誘導(dǎo)的升溫時間對發(fā)酵的影響〔8〕高密度對發(fā)酵的影響單純追求高密度發(fā)酵的結(jié)果是徒然的沒有明顯的蛋白產(chǎn)物條帶，發(fā)酵產(chǎn)物沒有生產(chǎn)應(yīng)用價值工程酵母的培養(yǎng)與發(fā)酵基因工程乙肝疫苗通?？墒褂萌N表達系統(tǒng)，即酵母系統(tǒng)、哺乳動物細胞系統(tǒng)及疫苗病毒載體系統(tǒng)?！?〕乙肝基因工程酵母細胞重組質(zhì)粒由三局部組成穿梭質(zhì)粒103整理ppt〔2〕工程酵母菌株的制備與培養(yǎng)〔3〕工程酵母的發(fā)酵工程細胞的培養(yǎng)與發(fā)酵〔1〕工程細胞株〔2〕工程細胞的擴增培養(yǎng)〔3〕生物反響器的細胞培養(yǎng)與rhEPO的生產(chǎn)填充床生物反響器基因工程藥物的別離純化基因工程藥物別離純化的費用占整個生產(chǎn)費用的80%-90%特點：〔1〕產(chǎn)物大多數(shù)處于細胞內(nèi)，提取前需將細胞破碎〔2〕產(chǎn)物濃度較低、雜質(zhì)多，而最后成品要求到達的純度高〔3〕產(chǎn)物都是大分子蛋白質(zhì)，通常不穩(wěn)定，遇熱、極端pH、有機104整理ppt溶劑和剪切力等易引起失活。影響基因工程產(chǎn)物別離純化工藝設(shè)計的主要因素產(chǎn)物活性、純度和雜質(zhì)首先應(yīng)建立基因工程產(chǎn)物活性、純度及可能含有雜質(zhì)的有效檢測方法SDS、HPLC、毛細管電泳、等電點聚焦、肽譜分析和氨基酸分析產(chǎn)物表達形式和表達水平真菌和動植物細胞一般以分泌的形式表達特點：其表達基因產(chǎn)物的形式有胞內(nèi)不溶性表達〔包涵體〕、胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達等多種產(chǎn)物本身的分子特性產(chǎn)物的用途和需求量體外診斷試劑純度在80%以上，體內(nèi)治療產(chǎn)品應(yīng)到達98%以上105整理ppt各種產(chǎn)物表達形式采用的別離純化方法細胞內(nèi)不溶性表達產(chǎn)物包涵體高產(chǎn)量使某些目的蛋白質(zhì)以不溶性形式產(chǎn)生并聚集形成蛋白質(zhì)聚合物包涵體?！?〕菌體細胞的收集與破碎物理、化學(xué)和酶學(xué)三種方法超聲波破碎、高壓勻漿和加沙研磨堿和外表活性劑〔2〕包涵體的別離、洗滌與溶解離心法低濃度弱變性劑〔如尿素〕外表活性劑〔如TritonX-100〕硫酸鏈霉素沉淀和酚抽提106整理ppt溶解包涵體打斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價鍵、離子鍵和疏水作用溶解包涵體的試劑包括尿素、煙酸胍、SDS、堿性溶劑和有機溶劑還有一種用離子交換樹脂溶解包涵體的方法〔3〕變性蛋白質(zhì)的純化柱層析、凝膠過濾、離子交換層析和高效液相色譜〔HPLC〕〔4〕重組蛋白質(zhì)的復(fù)性分泌型表達產(chǎn)物濃縮的方法包括沉淀和超濾沉淀包括中性鹽、有機溶劑和高分子聚合物等方法截留不同分子量的膜供給3大腸桿菌細胞內(nèi)可溶性表達產(chǎn)物親和層析別離法107整理ppt大腸桿菌細胞周質(zhì)表達蛋白滲透壓休克的方法回收到高質(zhì)量的蛋白產(chǎn)物基因工程藥物的質(zhì)量控制產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、平安性、穩(wěn)定性和一致性108整理ppt

第三章細胞工程制藥Questionone：1什么叫細胞工程？它有哪幾大核心技術(shù)2舉例說明細胞工程的應(yīng)用3什么叫細胞融合？有哪些主要類型？哪些方法？第一節(jié)細胞工程概述它是應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的理論和技術(shù)，按照人們的需要，有方案、大規(guī)模地培養(yǎng)生物組織和細胞以獲得生物及其產(chǎn)品，或者通過改變細胞的遺傳組成以產(chǎn)生新的種或品種。動植物細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)細胞融合和細胞器操作技術(shù)染色體工程技術(shù)、DNA重組技術(shù)菌苗、疫苗、抗生素、生物活性物質(zhì)、抗體等五大類把淋巴細胞雜交瘤技術(shù)與DNA重組技術(shù)結(jié)合起來使用109整理ppt110整理ppt細胞工程與基因工程的差異除被轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)的水平以及方法完全不同外，在選擇、純化、鑒定等步驟與方法等方面根本類似。細菌添加劑甾體激素可以采用微生物反響與化學(xué)反響相結(jié)合的方式來生產(chǎn)11a位羥化反響、11b位羥化反響、氧化反響和脫氫反響第二節(jié)細胞融合細胞融合技術(shù)的開展細胞融合是指人為的使兩種不同的生物細胞在同一培養(yǎng)器中，用無性的人工方法進行直接接觸，產(chǎn)生能同時表達兩個親本細胞有益性狀的細胞雜交技術(shù)。植物或微生物原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合111整理ppt112整理ppt細胞融合可發(fā)生于同種生物之間，如卵子與精子相融合形成受精卵，然后再繁殖成個體，這是一種有性過程。1838年Miller多核細胞1875年蛙的血細胞中也存在多核細胞人們發(fā)現(xiàn)麻疹病毒和腮腺炎病毒能引起細胞融合岡田善雄用高濃度仙臺病毒在體外使小鼠艾氏腹水瘤細胞得以融合1975年Milstein和Kohlor兩人首先將骨髓瘤細胞和脾細胞進行融合，創(chuàng)立了雜交瘤技術(shù)。1972年卡爾遜揭開了植物細胞雜交的序幕馬鈴薯和番茄的原生質(zhì)體進行融合溶菌酶蝸牛酶化學(xué)融合方法聚乙二醇〔PEG〕113整理ppt雞紅細胞與酵母細胞的融合HeLa細胞與煙草細胞的融合同時也正朝著將抗藥性和胞質(zhì)雄性不育等細胞質(zhì)基因?qū)肓硪粋€體細胞的方向開展，有可能形成新的核質(zhì)雜種。細胞工程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移途徑細胞遺傳物質(zhì)是指DNA，包括細胞核DNA、細胞質(zhì)葉綠體DNA、線粒體DNA和質(zhì)粒DNA等。遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移技術(shù)是指轉(zhuǎn)移核或含有DNA的細胞器的技術(shù)1完整細胞之間的融合作用首先要制備出強選擇性的兩種親本細胞一般取對數(shù)生長期細胞為融合材料常常發(fā)生染色體喪失114整理ppt核體與完整細胞或胞質(zhì)體的融合作用細胞松弛素B松胞素B〔CB〕作用下細胞核能從細胞質(zhì)中別離出來細胞核連同其外面薄層細胞質(zhì)構(gòu)成的顆粒稱為核體不具有細胞核而僅有細胞質(zhì)的細胞稱為胞質(zhì)體胞質(zhì)體與完整細胞的融合作用脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞融合將重組DNA分子包埋于脂質(zhì)體微囊內(nèi)，通過脂質(zhì)體微囊與宿主細胞融合作用，將外源性目的基因轉(zhuǎn)移至宿主體內(nèi)的過程。脂質(zhì)體的制備過程是在含重組DNA分子的水溶液中參加磷脂及吐溫80等乳化劑，通過劇烈攪拌或超聲波處理，將磷脂分散于水溶液中，靜置后，磷脂分子那么群集成液晶態(tài)脂質(zhì)雙層薄膜，將含重組DNA分子的水滴包裹于微囊內(nèi)，構(gòu)成一個人工原生質(zhì)體及脂質(zhì)體。115整理ppt抗藥性受細胞質(zhì)控制，主要受細胞質(zhì)中的線粒體、葉綠體控制。微細胞與完整細胞的融合一個或幾個染色體外包裹一薄層細胞質(zhì)的小體稱為微細胞對數(shù)生長期的動物細胞用秋水仙素處理微細胞雜種細胞生物大分子引入完整細胞細胞融合的方法PEG，它具有強烈的吸水性以及凝聚、沉淀蛋白質(zhì)的作用1000-6000的PEG均可用作促溶劑PEG對細胞有一定毒性作用，相對分子質(zhì)量越大，其毒性作用越強應(yīng)預(yù)先測試PEG對細胞的毒性作用及使用條件，包括融合時PEG的實際濃度、作用時間及反響溫度。116整理ppt

可通過電脈沖作用促進細胞融合，這種方法叫電融合。最低電場強度，使排成單行的細胞既不形成珠鏈，又使不同類型的兩個細胞具有一定的吸引力，進而能互相配對，形成融合細胞。影響細胞融合的因素在細胞融合過程中，除促溶劑外，溫度、pH、離子強度及離子種類等均影響細胞融合率。通常耗氧量較大融合時最適離子濃度一般為0.10mol/L，最適pH值為7.4-7.8五細胞融合操作中的技術(shù)問題親本細胞的選擇細胞具有全能性體細胞發(fā)育成植株的可能性也有極大差異117整理ppt選擇酶缺陷型、營養(yǎng)缺陷型、對藥物敏感的細胞；或者設(shè)法在體外培養(yǎng)過程中使細胞產(chǎn)生變異而獲得某些新的有用性狀。變異細胞的篩選方法利用微環(huán)境的變化在細胞水平上誘發(fā)變異和進行選擇變異細胞可供三方面應(yīng)用，一是大量培養(yǎng)細胞，獲得有用代謝產(chǎn)物；二是形成植株，培育農(nóng)作物新品種；三是用作細胞雜交的親本細胞。1正選擇系統(tǒng)負選擇系統(tǒng)5-溴脫氧尿苷〔BUdB〕系統(tǒng)和高氯酸系統(tǒng)提高雜種細胞形成率的措施局部異核體因核DNA復(fù)制與核分裂不協(xié)調(diào)而死亡通常把雜種細胞占原親本細胞的百分率稱為雜種細胞形成率Questiontwo：1細胞融合操作中應(yīng)注意哪些問題？

2雜種細胞的篩選是什么？有哪些主要篩選系統(tǒng)？118整理ppt原生質(zhì)體與雜種細胞形成率的關(guān)系原生質(zhì)球之間也有融合現(xiàn)象的出現(xiàn)，而且雜種細胞形成率高于原生質(zhì)體融合的對照組。原生質(zhì)體受到酶的損傷，不容易使細胞壁再生影響多核體核DNA復(fù)制的因素通常將一個細胞內(nèi)含有多個細胞核的細胞稱為多核體同型多核體異型多核體〔異核體〕異核體內(nèi)幾個細胞核DNA的合成以及細胞分裂能否趨于同步，是決定異核體能否生長與繁殖的關(guān)鍵，它和融合時親本細胞的生理狀態(tài)、親本細胞所處的生理周期以及親本細胞的種類等因素有關(guān)。細胞周期可分為G1期、S期、G2期與M期四個時期119整理ppt間期有絲分裂期只要在G1期早期合成了一定量的蛋白質(zhì)，細胞就能無阻礙的進入S期早熟染色體凝集可能會逐漸死亡或發(fā)生染色體喪失選用S期細胞作為融合親本比較適宜營養(yǎng)缺陷型親本細胞的生理效應(yīng)對雜種細胞形成率的影響穩(wěn)定雜種細胞的遺傳性細胞融合形成的雜種細胞，經(jīng)常會發(fā)生染色體喪失穩(wěn)定它的遺傳性一在融合后要盡可能多的篩選出顯示有用性狀的雜種細胞只有從大量有用性狀尚不穩(wěn)定的雜種細胞篩選120整理ppt二雜種細胞傳代過程中，要盡量穩(wěn)定培養(yǎng)條件在融合前把一個親本細胞也培養(yǎng)在有用性狀親本細胞的環(huán)境中雜種細胞的篩選原理及篩選系統(tǒng)篩選原理異型融合細胞、兩種同型融合細胞〔雙核或多核〕、未發(fā)生融合的兩種親本細胞。在培養(yǎng)過程中利用選擇性培養(yǎng)基，終止同型多核、異型多核以及未融合親本細胞的繁殖，僅允許異型多核細胞繁殖。篩選系統(tǒng)抗藥性篩選系統(tǒng)細胞的生長受到藥物A抑制對藥物B不敏感；另一種親本細胞的生長受到藥物B的抑制對藥物A不敏感。121整理ppt將兩種親本細胞的融合混合物置于同時含有藥物A和藥物B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩種親本細胞的生長均受到抑制而死亡，唯有融合子可以存活。營養(yǎng)互補選擇系統(tǒng)營養(yǎng)缺陷型細胞利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理篩選雜種細胞的方法稱營養(yǎng)互補選擇法。雜種細胞有用性狀的檢測系統(tǒng)雜種細胞能產(chǎn)生一些對人類有用物質(zhì)的性狀或?qū)θ祟惿钣欣男誀?，統(tǒng)稱為有用性狀。雜種細胞早期存在的一些性狀在傳代過程中也會消失一方面要穩(wěn)定培養(yǎng)條件，同時也要定期檢測雜種細胞的有用性狀免疫學(xué)反響、遺傳標記、核酸分子雜交Questionthree：1如何檢測雜種細胞的有用性狀

2有幾種主要的雜種細胞表型改變？其本質(zhì)是什么？122整理ppt免疫學(xué)反響主要是檢測雜種細胞外表或基因表達產(chǎn)物如蛋白質(zhì)、酶和多肽熒光素、辣根過氧化物酶或放射性同位素結(jié)合在一起免疫熒光、免疫酶標與放射免疫測定細胞原位雜交或分子雜交的方法控制雜種細胞遺傳表現(xiàn)型的機制1互補作用是指兩種親本細胞的某些生物學(xué)特性在雜種細胞中共同表達的現(xiàn)象2激活作用是指某一親本細胞的不活動基因在雜種細胞中被激活而得到表達的現(xiàn)象3消失作用是指親本細胞的某一〔或某些〕性狀在雜種細胞中消失的現(xiàn)象4激活與消失作用123整理ppt是指在雜種細胞中原來親本非活動基因被激活而同一親本某些遺傳性狀同時消失的現(xiàn)象。表現(xiàn)其生物學(xué)特性的實質(zhì)，就是基因的重組、調(diào)控與表達的問題可能是細胞質(zhì)中的某種活性物質(zhì)對某一基因組起了激活或抑制作用的結(jié)果前者叫基因重組，或者叫基因調(diào)控微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)微生物原生質(zhì)體融合就是將兩個親株的細胞壁分別通過酶解作用加以去除，使其在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀原生質(zhì)體，然后將兩個親株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，在外力作用下〔如采用PEG或加壓〕助融，使它們相互凝集進行細胞質(zhì)融合，接著發(fā)生兩套或多套基因組之間的接觸，交換和重組，在再生細胞中獲得異核體或重組體。