大蒜素和辛伐他汀對肺癌A549細(xì)胞凋亡和增殖抑制的研究

大蒜素和辛伐他汀對肺癌A549細(xì)胞凋亡和增殖抑制的研究肺癌已經(jīng)成為當(dāng)今世界惡性腫瘤死亡的最主要原因。幾十年來不僅在中國世界各地惡性腫瘤死亡率的主要原因均為肺癌,而且在中國其發(fā)病率仍在不斷攀升。不幸的是,大多數(shù)肺癌患者直到疾病已經(jīng)發(fā)展到晚期才被診斷出來。鱗狀細(xì)胞癌(Squamous-cellcarcinoma,SCC)、腺癌、小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌是最常見的四個肺癌的組織學(xué)亞型。女性肺癌三個主要類型(鱗狀細(xì)胞癌,腺癌和小細(xì)胞癌)的發(fā)病率都增加了,尤其快速增加的腺癌已經(jīng)成為當(dāng)今女性肺癌的主要類型。而在男性中,鱗狀細(xì)胞癌成為占主要地位的肺癌類型。這可能是由于改變了吸煙習(xí)慣或煙草相關(guān)產(chǎn)品(如低焦油含量香煙和使用過濾器或吸入器吸煙)。近年來在許多國家中,肺腺癌在男性當(dāng)中的發(fā)病率已經(jīng)遠(yuǎn)超過鱗狀細(xì)胞癌,成為主要的肺癌類型。由于女性對腺癌易感性的不斷增加,需要更多的研究來闡明相關(guān)的分子機(jī)制,并最終找到最理想的治療方法。流行病學(xué)調(diào)查顯示,大蒜(大蒜屬植物)的消費與許多癌癥死亡率成反比關(guān)系。主要的流行病學(xué)調(diào)查顯示食用大蒜可以顯著降低消化道惡性腫瘤的死亡率,在中國最明顯的就是胃癌死亡率。一系列大蒜衍生化合物(也稱為有機(jī)硫化合物)(Organsulfercompounds,OSC),包括水溶性硫化合物如S-烯丙半胱氨酸(S-allylcysteine,SAC)和S-烯丙基巰基半胱胺酸(S-allylmercaptocysteine,SMAC)和脂溶性硫化合物,即烯丙基硫醚(Diallylsulfide,DAS),二烯丙基二硫化物(Diallyldisulfide,DADS),二烯丙基三硫化物(Diallyltrisulfide,DATS)和阿焦烯,已被豐富的、已經(jīng)發(fā)表的實驗室證據(jù)證明有預(yù)防肺癌的生物學(xué)作用。二烯丙基三硫化物(DATS)是大蒜衍生化合物(也被稱為有機(jī)硫化合物OSC)。DATS可以誘導(dǎo)許多種癌細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡并抑制其生長。盡管,是否因為分子中不同數(shù)量的硫原子造成了不同個體硫化丙烯的生物化學(xué)及毒理學(xué)的不同這一觀點還未被充分的證明,但是DATS,因其結(jié)構(gòu)中含有硫烷硫,相比較SAC、SMAC、DADS、DADS而言,具有更強(qiáng)的生物活性和更大的毒性。越來越多的證據(jù)表明,DATS顯示了潛在的對肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌、前列腺癌等細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的能力。它已經(jīng)被證明在人類肺癌細(xì)胞株H358和H460中能夠通過增加親凋亡蛋白和減少抗凋亡蛋白的產(chǎn)生而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生,但并沒有改變Bax和Bak蛋白的表達(dá)。然而上述情況在正常的人類支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B中卻并非如此。然而,DATS如何能夠抑制肺癌細(xì)胞系的增殖并誘導(dǎo)其凋亡但正常細(xì)胞卻仍能夠存活的具體途徑仍不得而知,甚至偶爾還會出現(xiàn)使用相同的細(xì)胞株卻得出完全相互矛盾的結(jié)果的情況。除此之外,關(guān)于DATS在體外和體內(nèi)的系統(tǒng)研究數(shù)據(jù)仍相對少見。以上所有這些相關(guān)研究中,只有一個是關(guān)于DATS和硒在中國自然村莊人口中對胃癌的化學(xué)防癌作用的干預(yù)試驗。由于樣本中女性的數(shù)量較少,需要更多的相關(guān)研究。相對于癌細(xì)胞而言,對非腫瘤細(xì)胞的低毒性是任何一個化學(xué)防癌試劑所必備的先決條件。我們的研究旨在試圖通過明確DATS誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的同時避免非腫瘤細(xì)胞的凋亡的分子機(jī)制從而驗證DATS是一個理想的化學(xué)防癌劑。本實驗第一部分的研究旨在探討,DATS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否通過降低抗凋亡因子bcl-2,導(dǎo)致Bax/Bcl-2比例和半胱天冬酶3、8的活性的上調(diào),是否產(chǎn)生線粒體依賴的、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)的級聯(lián)反應(yīng)。DATS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和增殖抑制是否呈現(xiàn)出擴(kuò)散濃度和時間依賴性。不僅如此,通過建立移植了A549肺癌細(xì)胞的雌性BALB/c裸小鼠動物模型,我們希望能夠明確喂飼DATS的裸小鼠相對對照組而言,其A549肺癌細(xì)胞移植物是否能出現(xiàn)顯著的生長阻滯并且不引起體重減輕或任何其他副作用。希望通過本實驗第一部分的研究能夠進(jìn)一步探討DATS是否可以作為理想的抗癌藥物。他汀類藥物,作為羥甲基戊二酸輔酶A(HydroxymethylglutarylcoenzymeA,HMG-CoA)還原酶抑制劑,是一類能夠有效降低血漿膽固醇水平的藥物。他汀類藥物在降低心血管疾病的發(fā)病率與死亡率方面有著無可爭議的地位,并且已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于心源性疾病的一線和二線預(yù)防用藥。除了降低血脂的功效外,他汀類藥物在體內(nèi)與體外模型中還表現(xiàn)出抗癌特性。他汀類藥物介導(dǎo)的蛋白酶體活性與細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。近年來已有報道證實,他汀類藥物在體外能夠改變丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的信號傳導(dǎo)并在降低細(xì)胞增值率方面發(fā)揮一定作用。除此之外,還有報道指出,他汀類藥物能夠增加一系列腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)化療藥物的敏感性。實際上,他汀類藥物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在一系列腫瘤細(xì)胞諸如結(jié)直腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出抗癌特性。但是,迄今為止,應(yīng)用他汀類藥物對抗腫瘤進(jìn)展仍存在著爭議。一些報道顯示,他汀類藥物并沒有降低實驗?zāi)Ｐ椭邪┌Y的發(fā)生率,但在同一細(xì)胞系中有時能出現(xiàn)完全相矛盾的結(jié)論。據(jù)我們所知,關(guān)于肺癌與他汀類藥物的相關(guān)研究檢測罕見報道。更主要的是,他汀類藥物抗癌特性的分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。所以,需要更多關(guān)于他汀類藥物如何在肺癌中發(fā)揮抗癌和化學(xué)防癌作用的研究。本研究的第二部分中,我們假設(shè)他汀類藥物治療可能通過抑制細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞周期、下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependentkinase,CDKs)的蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)水平來達(dá)到抑制肺癌進(jìn)展的作用。應(yīng)用人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和最具代表性的他汀類藥物-辛伐他汀的體外實驗被設(shè)計出以檢測我們這一假設(shè)。希望通過本實驗第二部分的研究能夠進(jìn)一步探討辛伐他汀是否可以作為理想的抗癌及化學(xué)防癌藥物。一、大蒜素對肺癌A549細(xì)胞凋亡及增殖抑制的體外與體內(nèi)研究目的通觀察DATS誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡時抗凋亡因子bcl-2及Bax/Bcl-2比例和半胱天冬酶3、8的活性的變化,產(chǎn)生的線粒體依賴的、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)的級聯(lián)反應(yīng)的情況；通過建立移植了A549肺癌細(xì)胞的雌性BALB/c裸小鼠動物模型,比較喂飼DATS的裸小鼠相對對照組而言,其A549肺癌細(xì)胞移植物出現(xiàn)了顯著的生長阻滯并且不引起體重減輕或任何其他副作用的情況。從而驗證DATS是一個理想的化學(xué)防癌劑。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：在含10%FBS、1%的青霉素-鏈霉素的RPMI1640中,37℃、5%二氧化碳、95%空氣加濕條件下,細(xì)胞培養(yǎng)孵化器內(nèi)培養(yǎng)人類肺癌細(xì)胞株(A549)。2.MTT檢測：用MTT法測定A549所受DATS的細(xì)胞毒性。將細(xì)胞種于96孔板(5×105細(xì)胞／毫升),用三個濃度(25μm,50μm,100μm)DATS分別刺激1小時。然后更換新的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。所有細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測。每組取5孔并計算平均值。3.RNA的提取及半胱天冬酶3、8的實時定量PCR：所有組細(xì)胞均用TRIzolKit試劑提取總RNA。進(jìn)行半胱天冬酶3、8的實時定量PCR。引物序列如下：GAPDH:forward,5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’reverse,5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’;caspase-3:forward,5’-TGCATACTCCACAGCACCTGGTTA-3’reverse,5’-CATGGCACAAAGCGACTGGATGAA-3’;caspase-8:forward,5’-TTTCACTGTGTTAGCCAGGGTGGTA-3’reverse,5’-CCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAG-3’。GAPDH作為內(nèi)參使用,并且所有實驗均重復(fù)5次。4.半胱天冬酶3、8的活性檢測：應(yīng)用比色測定試劑盒測定細(xì)胞中半胱天冬酶3、8的活性。使用的細(xì)胞為單獨培養(yǎng)及使用100μmDATS刺激后72小時的A549細(xì)胞。所有檢測均重復(fù)3次。5.蛋白印跡分析：單獨或與DATS一起培養(yǎng)的A549細(xì)胞中的所有蛋白提取出后,加樣到12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。然后電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1小時后,與包括bcl-2、Bax的一抗孵育過夜。與含有熒光二抗的辣根過氧化物酶孵育后TBST洗滌三次,用化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白。6.動物實驗：四十個雌性BALB/c裸小鼠(6周齡)購自中國科學(xué)院動物研究所。整個實驗過程中,飼養(yǎng)于無特定病原體及食物和水隨意取用的條件下。動物協(xié)議依據(jù)山東大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)則。A549細(xì)胞被用來建立腫瘤模型的裸鼠。主要為,準(zhǔn)備A549的單一細(xì)胞懸液。老鼠皮下注射懸于100μlPBS中的A549細(xì)胞懸液(5×106/只),同時,小鼠隨機(jī)分為兩組。一組口飼溶于100μlPBS中的6μmDATS隔日一次(DATS組,n=20)；另一組口飼100μlPBS(對照組,n=20)。觀察動物一般情況。30天處死后檢測腫瘤的發(fā)生率及腫瘤體積。7.所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。通過單向方差分析和t檢驗建立統(tǒng)計學(xué)意義。使用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0.P<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.DATS在體外抑制A549細(xì)胞的存活：通過MTT法檢測DATS作用后的腫瘤細(xì)胞存活率,我們發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞與DATS孵育后其活性被明顯抑制。不僅如此,這種對腫瘤細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。2.DATS在體外升高半胱天冬酶3、8的表達(dá)：半胱天冬酶3、8的mRNA表達(dá)量在DATS作用組較對照組顯著升高。同時,我們檢測了半胱天冬酶3、8的體外活性。在使用100μmDATS刺激48小時后,半胱天冬酶3、8的活性較對照組有顯著的提高。3.DATS在體外誘導(dǎo)Bcl-2的表達(dá)：Bcl-2在腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖及侵襲活動中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究中,我們通過檢測Bcl-2蛋白的表達(dá)量試圖揭示DATS對A549細(xì)胞作用的可能機(jī)制。結(jié)果顯示,DATS的作用導(dǎo)致了A549細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)的顯著下調(diào)。本實驗中,我們分別建立了不同的濃度及時間梯度。我們發(fā)現(xiàn)100μmDATS較其它兩組能夠取得更大的作用,從而進(jìn)一步說明DATS對A549細(xì)胞的作用呈劑量依賴性。較對照組和24小時組而言,Bcl-2蛋白表達(dá)在48小時組的下降尤為顯著。但是,Bcl-2蛋白表達(dá)在72小時組并沒有進(jìn)一步下降。4.DATS在體內(nèi)抑制肺癌細(xì)胞的生長：我們通過建立的BALB/c裸鼠模型來檢測DATS的抗腫瘤作用。通過攝入DATS,實驗組裸鼠較對照組裸鼠而言,腫瘤的發(fā)生率及腫瘤的體積均能夠顯著下降。結(jié)論我們的研究表明,DATS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過顯著降低抗凋亡因子bcl-2,從而導(dǎo)致Bax/Bcl-2比例和半胱天冬酶3、8的活性的上調(diào),產(chǎn)生的線粒體依賴的、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)的級聯(lián)反應(yīng)。DATS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和增殖抑制呈現(xiàn)出擴(kuò)散濃度和時間依賴性。不僅如此,通過建立移植了A549肺癌細(xì)胞的雌性BALB/c裸小鼠動物模型,我們發(fā)現(xiàn)喂飼DATS的裸小鼠相對對照組而言,其A549肺癌細(xì)胞移植物出現(xiàn)了顯著的生長阻滯并且不引起體重減輕或任何其他副作用。以上所有的體外和體內(nèi)實驗證據(jù)均表明DATS可以作為理想的抗癌藥物。二、辛伐他汀對肺癌A549細(xì)胞凋亡及增殖抑制的研究目的肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。近些年來,已有文獻(xiàn)報道他汀類藥物具有抗癌及化學(xué)防癌的特性。但是辛伐他汀在肺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制仍不明確。本部分研究旨在進(jìn)一步明確辛伐他汀對肺癌A549細(xì)胞凋亡及增殖抑制的作用機(jī)制。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：在含10%FBS、1%的青霉素-鏈霉素的RPMI1640中,37℃、5%二氧化碳、95%空氣加濕條件下,細(xì)胞培養(yǎng)孵化器內(nèi)培養(yǎng)人類肺癌細(xì)胞株(A549)。2.MTT檢測：MTT法測定A549細(xì)胞在辛伐他汀作用下的存活率。將細(xì)胞種于96孔板(5×105細(xì)胞/孔,200μl)過夜。分為對照組與刺激組,刺激組用三個濃度(1μm,l0μm,50μm)辛伐他汀分別刺激48小時。孵育后將MTT液加入到每個孔當(dāng)中檢測A549細(xì)胞所受細(xì)胞毒性。每組取5孔并計算平均值。3.細(xì)胞周期分析：對照組細(xì)胞每孔單獨孵育,辛伐他汀組細(xì)胞用50μm辛伐他汀孵育48小時。按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書常規(guī)操作。4.RNA的提取及實時定量PCR：所有組細(xì)胞均用TRIzolKit試劑提取總RNA。進(jìn)行半胱天冬酶3、8、9及Xiap的實時定量PCR。引物序列如下：GAPDH:forward,5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’reverse5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’;caspase-3:forward,5’-.TGCATACTCCACAGCACCTGGTTA-3’reverse,5’-CATGGCACAAAGCGACTGGATGAA-3’;caspase-8:forward,5’-TTTCACTGTGTTAGCCAGGGTGGTA-3’reverse,5’-CCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAG-3’;caspase-9:forward,5’-GCTTCGTTTCTGCGAACTAACA-3’reverse,5’-GTTGGCTTCGACAACTTTGCT-3’;Xiap:forward,5’-CACTTGAGGTTCTGGTTGCAG-3’reverse,5’-TGCAAAGCTTCTCCTCTTGC-3’。GAPDH作為內(nèi)參使用,并且所有實驗均重復(fù)5次。5.蛋白印跡分析：單獨或與辛伐他汀一起培養(yǎng)的A549細(xì)胞中的所有蛋白提取出后,BCA法檢測蛋白濃度,加樣到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。然后電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2小時后,與包括鼠bcl-2、兔Bax、兔細(xì)胞周期蛋白D1、兔CDK4、兔caspase-3、兔caspase-8、兔caspase-9、兔Xiap蛋白、兔MMP-9、兔NF-κB以及兔β-actin的一抗孵育過夜。與含有熒光二抗的辣根過氧化物酶室溫孵育2小時后,用TBST洗滌三次,用化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白。6.所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。通過單向方差分析和t檢驗對照組與刺激組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。使用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0.P<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。結(jié)果1.辛伐他汀抑制A549細(xì)胞的存活：通過MTT法檢測辛伐他汀作用后的A549細(xì)胞存活率,我們發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞與不同濃度(1μm,10μm,50μm)辛伐他汀孵育48小時后,較對照組而言,10μm和50μm能夠顯著抑制細(xì)胞存活,1μm組能輕度抑制A549細(xì)胞,但結(jié)果沒有統(tǒng)計學(xué)差異。辛伐他汀對A549細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。2.辛伐他汀導(dǎo)致A549細(xì)胞Bcl-2的下調(diào)和Bax的上調(diào)表達(dá)：Bcl-2和Bax家族在腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖及侵襲活動中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本部分研究中,我們通過蛋白印跡法檢測了Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)量。值得注意的是,為了評價A549細(xì)胞時間及濃度反應(yīng)性,我們用不同濃度的辛伐他汀刺激了不同時間。就時間反應(yīng)性,48小時組取得最顯著的效果。另外,50μm組相對其它濃度組能夠顯著減低Bcl-2并升高Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,辛伐他汀對A549細(xì)胞的作用呈時間和劑量依賴性。所以50μm刺激48小時被用作進(jìn)一步的實驗。3.辛伐他汀對細(xì)胞周期的作用：我們通過檢測腫瘤細(xì)胞細(xì)