多肽的酶法聚乙二醇透明質(zhì)酸定點(diǎn)修飾及初步藥學(xué)性質(zhì)研究

多肽的酶法聚乙二醇/透明質(zhì)酸定點(diǎn)修飾及初步藥學(xué)性質(zhì)研究多肽一般指α-氨基酸以肽鍵連接形成的化合物,其作為藥物具有生物功能明確、作用專一、毒性低等優(yōu)點(diǎn),臨床上已被廣泛用于刺激造血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等。為克服其穩(wěn)定性差、半衰期短等缺點(diǎn),以聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)等聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾被認(rèn)為是簡單、有效的策略?？紤]到現(xiàn)有化學(xué)法修飾多肽藥物尚存在反應(yīng)位點(diǎn)選擇性差、修飾率低及易導(dǎo)致活性損失等問題,我們嘗試采用酶催化法對(duì)多肽藥物進(jìn)行PEG或透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)定點(diǎn)修飾,所采用的工具酶是一種來源于茂源鏈霉菌(Streptomcyesmobaraensis)的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(microbialtransglutaminase,mTGase)。mTGase可以催化谷氨酰胺(glutamine,Gln)的γ-甲酰胺基和賴氨酸(lysine,Lys)的伯胺基之間形成新的酰胺鍵。據(jù)此,本研究以含Gln或Lys殘基的胸腺五肽(thymopentin,TP5;氨基酸序列為RKDVY)、抗腫瘤多肽PCK3145(氨基酸序列為EWQTDNCETCTCYGT)以及設(shè)計(jì)的抗血管生成活性多肽ES2-TH(氨基酸序列為IVRRADRAAVPGGCGKRK)為研究對(duì)象,以末端功能化的PEG或HA為修飾劑,由mTGase催化進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾;測定得到的PEG/HA-多肽綴合物的藥代動(dòng)力學(xué)特征和體外活性,并比較與未修飾多肽的差異。本研究旨在利用mTGase酶催化實(shí)現(xiàn)多肽藥物的PEG/HA高效、定點(diǎn)修飾。本學(xué)位論文的研究內(nèi)容和取得的主要成果如下:1.PEG-多肽綴合物的酶法合成與表征(1)PEG-ZQG的合成與表征mTGase的二肽底物芐氧羰基-L-谷氨酰胺-甘氨酸(benzyloxycarbonyl-L-glutamine-glycine,ZQG)的羧基經(jīng)EDC/NHS活化后,與叔丁基胺聚乙二醇胺(BOC-PEG-NH2)的氨基反應(yīng)得到PEG-ZQG,反應(yīng)產(chǎn)率為75.3%。紫外-可見掃描譜圖顯示,PEG-ZQG與ZQG均在255nm處具有特征吸收峰;PEG-ZQG的1HNMR譜圖在δ=7.47-7.17ppm處新增ZQG苯環(huán)的特征信號(hào)峰,因此含單一Gln殘基的PEG-ZQG的合成成功。(2)PEG-TP5的制備與表征由于TP5含單一Lys殘基,故嘗試在mTGase的催化下,使之與PEG-ZQG的Gln殘基共價(jià)相連。反應(yīng)液經(jīng)Superdex30凝膠柱純化得到產(chǎn)物(命名為PEG-TP5),反應(yīng)產(chǎn)率為78.5%;HPLC分析表明PEG-TP5的純度為96.6%。與TP5類似,PEG-TP5的紫外-可見掃描譜圖顯示其于220nm和275nm處具特征吸收峰。其1HNMR譜圖在δ=7.02ppm和δ=6.73ppm處增加TP5酪氨酸殘基中苯環(huán)的特征信號(hào)峰;在δ=6.73ppm處增加了TP5纈氨酸殘基中兩個(gè)甲基的特征信號(hào)峰;與TP5的賴氨酸殘基側(cè)鏈C4-H的信號(hào)峰(δ=2.53ppm)相比,PEG-TP5對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰向低場移動(dòng)(δ=3.18ppm),表明PEG-ZQG對(duì)TP5賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾。綴合物中TP5的苯環(huán)氫信號(hào)峰和BOC-PEG-NH2的叔丁基氫信號(hào)峰(δ=1.32ppm)的積分比為0.41:1,由于每個(gè)TP5分子中含有4個(gè)芳香氫,每個(gè)BOC-PEG-NH2分子中含有9個(gè)叔丁基氫,可計(jì)算得綴合物的TP5與PEG分子數(shù)比為1:1。2.HA-多肽的酶法合成與表征(1)6-O-硫酸化HA的制備與表征HA先以離子交換法轉(zhuǎn)化為四丁基銨鹽,再以不同濃度的三氧化硫吡啶絡(luò)合物對(duì)其進(jìn)行硫酸化修飾,得到不同硫酸化程度的硫酸化HA(sulfatedHA,SHA)。元素分析結(jié)果顯示SHA-1、SHA-2、SHA-3和SHA-4的硫氮原子比分別為0.0500、0.9333、1.453和2.888。其中SHA-2的1HNMR譜圖顯示位于δ=3.4ppm的C6-H的信號(hào)峰向低場移動(dòng),而C2-H、C3-H和C4-H的信號(hào)峰未發(fā)生明顯改變。因此,SHA-2為C6-OH定點(diǎn)硫酸化的HA衍生物。(2)HA-HMD的制備與表征由于HA結(jié)構(gòu)中無游離氨基,采用還原胺化反應(yīng)于HA末端連接1,6-己二胺(hexamethylenediamine,HMD)。HA-HMD的1HNMR譜圖在δ=1.35ppm、δ=1.60ppm和δ=2.90ppm處出現(xiàn)三個(gè)積分值相近的信號(hào)峰,分別為HMD的α-H、β-H和γ-H的信號(hào)峰,表明HA-HMD的結(jié)構(gòu)與預(yù)期相符。(3)HA-ZQG的制備與表征采用合成PEG-ZQG類似的方法,使HA-HMD的末端氨基與ZQG的羧基共價(jià)相連制備HA-ZQG,反應(yīng)產(chǎn)率為86.9%。HA-ZQG的1HNMR譜圖在δ=7.45-7.25ppm處新增苯環(huán)的特征信號(hào)峰,表明含Gln的HA-ZQG合成成功。(4)HA-TP5的制備與表征經(jīng)mTGase酶催化,TP5與HA-ZQG發(fā)生修飾反應(yīng),純化得到產(chǎn)物(HA-TP5),反應(yīng)產(chǎn)率為82.7%,HA-TP5的純度為95.1%。HA-TP5的1HNMR譜圖在δ=7.02ppm和δ=6.73ppm處新增TP5酪氨酸殘基中苯環(huán)的特征吸收峰;在δ=3.78ppm處出現(xiàn)TP5氨基酸的α-H信號(hào)峰;在δ=0.99ppm處出現(xiàn)TP5纈氨酸的甲基信號(hào)峰,故TP5被HA共價(jià)修飾。綴合物中HA的異頭氫信號(hào)峰與氨基酸α-H信號(hào)峰積分值比例為1:0.29,由于每個(gè)TP5分子中含有5個(gè)α-H,每個(gè)HA分子中平均含18個(gè)異頭氫,計(jì)算得平均一分子HA連接1個(gè)TP5。(5)HA-PCK3145的制備與表征在mTGase催化下,嘗試以含伯氨基的HA-HMD修飾PCK3145的單一Gin殘基,純化得到新產(chǎn)物(HA-PCK3145),反應(yīng)產(chǎn)率為81.7%,純度為88.3%。HA-PCK3145的1HNMR譜圖顯示在δ=8.32ppm處出現(xiàn)PCK3145酪氨酸和色氨酸的苯環(huán)特征吸收峰;δ=3.88-3.77ppm處出現(xiàn)PCK3145各個(gè)氨基酸的α-H信號(hào)峰,δ=2.51ppm處出現(xiàn)谷氨酸殘基、谷氨酰胺殘基和天冬氨酸殘基的特征信號(hào)峰,表明PCK3145的Gln殘基被HA定點(diǎn)修飾。綴合物中HA的異頭氫與氨基酸α-H的氫信號(hào)峰積分比例為1:0.8,由于每個(gè)PCK3145分子中含有15個(gè)α-H,每個(gè)HA分子平均含有18個(gè)異頭氫,可計(jì)算得平均一個(gè)HA上連接1個(gè)PCK3145多肽。(6)HA-ES2-TH的制備與表征以HA-HMD對(duì)ES2-TH的Lys進(jìn)行修飾,純化得到新產(chǎn)物(HA-ES2-TH),反應(yīng)產(chǎn)率為85.0%,純度為92.1%。HA-ES2-TH的1HNMR譜圖顯示的δ=3.76-3.94ppm的信號(hào)峰歸屬ES2-TH各個(gè)氨基酸α-H;在δ=2.56ppm處出現(xiàn)峰歸屬賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的與N或S原子直接相連的亞甲基;在δ=1.21ppm處出現(xiàn)的峰為異亮氨酸與纈氨酸中甲基的信號(hào)峰,表明ES2-TH被HA修飾成功。綴合物中HA的異頭氫與ES2-TH氨基酸的α-H信號(hào)峰的積分比例為1:1.24,由于每個(gè)ES2-TH含有18個(gè)α-H,每個(gè)HA分子中平均含有18個(gè)異頭氫,可計(jì)算得平均一個(gè)HA上連接1個(gè)ES2-TH多肽。(7)SHA-ES2-TH的制備與表征最后,以SHA-HMD修飾ES2-TH得到SHA-ES2-TH,反應(yīng)產(chǎn)率為80.0%,純度為96.4%。SHA-ES2-TH的1HNMR譜圖顯示的δ=3.76-3.94ppm的多個(gè)小峰為ES2-TH各個(gè)氨基酸α-H的特征信號(hào)峰;在δ=2.56ppm處出現(xiàn)峰為賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的與N或S原子直接相連的亞甲基的信號(hào)峰;在δ=1.21ppm處出現(xiàn)的峰為異亮氨酸與纈氨酸中甲基的信號(hào)峰。綴合物中SHA的異頭氫與ES2-TH氨基酸α-H信號(hào)峰的積分比例為1:1.18,由于每個(gè)ES2-TH分子中含有18個(gè)α-H,每個(gè)SHA分子中平均含有18個(gè)異頭氫,可計(jì)算得平均一個(gè)SHA上連接1個(gè)ES2-TH多肽。3.多肽綴合物藥代動(dòng)力學(xué)研究選用BALB/c小鼠作為動(dòng)物模型,以尾靜脈單次給藥后,測定不同時(shí)間點(diǎn)的血清藥物含量以評(píng)價(jià)不同多肽綴合物的藥代動(dòng)力學(xué)特征。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為均符合二室模型,根據(jù)其血藥濃度-時(shí)間曲線可知三者體內(nèi)分布半衰期t1/2q分別為0.5032min、4.257min和4.011min;消除半衰期t1/2β分別為29.45min、173.9min和224.5min,因此TP5經(jīng)PEG或HA修飾后,其半衰期均顯著延長。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在藥時(shí)曲線下面積AUCo-z分別為193.5μg·mL-1·min、924.2μg·mL-1·min和2382μg·mL-1·min,顯示PEG/HA-TP5的生物利用度較TP5顯著提高。與PCK3145相比,HA-PCK3145在小鼠體內(nèi)的t1/2α從22.37min延長至57.58min,t1/2β從219.5min延長至3032min,表明HA修飾的PCK3145半衰期顯著延長;與未修飾的PCK3145相比,HA-PCK3145的AUC0-z從1888μg·mL-1·min延長到6717μg·mL-1·min,表明修飾后的綴合物具有更高的生物利用度。與ES2-TH相比,HA-ES2-TH在小鼠體內(nèi)的t1/2α從17.46min延長至34.99min,t1/2β從243.3min延長至1703min,表明HA修飾的ES2-TH半衰期顯著延長;與未修飾的ES2-TH相比,HA-ES2-TH的AUC0-z從510.5μg·mL-·min延長到2958μg·mL-1·min,表明修飾后的綴合物具有更高的生物利用度。4.多肽綴合物體外活性的表征(1)PEG-TP5和HA-TP5的體外促淋巴細(xì)胞增殖活性采用MTT法測定TP5及PEG/HA-TP5體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,濃度分別為18.4μmol·L-1、36.8μmol·L-1、73.5μmol·L-1和147.1μmol·lL-1的TP5、PEG-TP5和HA-TP5在體外均具有顯著的刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性(P<0.05);PEG-TP5、HA-TP5的促淋巴細(xì)胞增殖率與相同濃度的TP5相比無顯著差異(P>0.05),因此IP5由mTGase催化進(jìn)行PEG或HA修飾,對(duì)其體外免疫活性影響不大。(2)HA-PCK3145的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性采用MTT法評(píng)價(jià)HA-PCK3145體外抗人乳腺癌細(xì)胞增殖作用。結(jié)果表明,濃度分別為14.26μmol·L-1、28.52μmol·L-1、57.04μmol·L-1和114.09μmol·L-1的PCK3145和HA-PCK3145體外均具有極顯著的抗人乳腺癌細(xì)胞增殖作用(P<0.01);相同濃度的HA-PCK3145與PCK3145的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性相當(dāng)(P>0.05),因此PCK3145由mTGase催化進(jìn)行HA修飾對(duì)其體外抗腫瘤活性影響不大。(3)HA-ES2-TH的體外抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性采用MTT法評(píng)價(jià)HA-ES2-TH體外抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。結(jié)果表明,濃度分別為26.18μmol·L-1、52.36μmol·L-1和104.71μmol·L-1時(shí),ES2、ES2-TH和HA-ES2-TH在體外均具有極顯著的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞