宮內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胚胎期顯性脊柱裂胎鼠神經(jīng)元重建的研究

PAGEPAGE39目錄一、摘要中文論著摘要3英文論著摘要6二、英文縮略語(yǔ)10三、論文前言11實(shí)驗(yàn)材料與方法11實(shí)驗(yàn)結(jié)果14討論23結(jié)論26本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)27參考文獻(xiàn)27四、附錄綜述31致謝41在學(xué)期間科研成績(jī)42個(gè)人簡(jiǎn)介43PAGEPAGE39·中文論著摘要·目的神經(jīng)管缺陷(Neuraltubedefects,NTDs)是常見(jiàn)的先天性畸形之一,世界范圍內(nèi)發(fā)病率占總出生兒數(shù)的1/1000～9/1000,是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的疾病之一,目前認(rèn)為神經(jīng)管缺陷是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,有家族遺傳傾向。胚胎發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)管發(fā)育缺陷可出現(xiàn)腦和脊髓畸形,其中腦裂和脊柱裂占所有類型的95%,脊柱裂根據(jù)椎管內(nèi)容物是否突出脊柱皮膚分為顯性脊柱裂和隱性脊柱裂。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的不斷提高，越來(lái)越多的神經(jīng)管畸形在孕中期或孕早期被發(fā)現(xiàn)，但是產(chǎn)前治療方面的研究卻進(jìn)展緩慢，許多母親被迫選擇終止妊娠，出生后的神經(jīng)畸形患兒的致殘率和死亡率也較高。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用胎兒外科技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前修補(bǔ)可以減少腦積水和腦疝的發(fā)生率，但對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)仍不理想，下肢感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙和尿便障礙仍然是常見(jiàn)的術(shù)后并發(fā)癥。干細(xì)胞移植治療出生缺陷是目前較先進(jìn)的治療方法，宮內(nèi)移植的優(yōu)點(diǎn)包括:1.由于胎兒在宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育快，因此為植入的干細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖提供了有利時(shí)機(jī)；2.MSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后進(jìn)行自體移植，不存在免疫反應(yīng)，而且避免了社會(huì)倫理問(wèn)題；3.能夠在疾病的早期得以及時(shí)治療。目前利用干細(xì)胞移植技術(shù)治療白血病及先天性免疫缺陷性疾病以有報(bào)道，但關(guān)于宮內(nèi)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)管畸形的報(bào)道卻很少。先天性神經(jīng)管發(fā)育畸形的治療一直是困擾國(guó)內(nèi)外學(xué)者的難題。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，先天性脊椎裂鼠支配肛門外括約肌和肛提肌的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，說(shuō)明脊柱裂的脊髓神經(jīng)元在胚胎期已經(jīng)存在明顯發(fā)育異常。因此我們認(rèn)為在顯性脊椎裂患兒術(shù)后神經(jīng)功能恢復(fù)的治療中，神經(jīng)元的再生或修復(fù)才是最重要的治療原則。移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞，這為先天性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的細(xì)胞替代治療提供了可能。因此本研究嘗試?yán)肕SCs進(jìn)行宮內(nèi)移植治療先天性脊椎裂，并對(duì)移植后干細(xì)胞的遷移和分化情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，探索先天性脊椎裂的治療新方法。材料和方法PAGEPAGE39一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1、原代培養(yǎng)4周齡Wistar鼠40只，體重90-100g。由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2、動(dòng)物模型10-12周齡Wistar孕鼠100只，體重250-300g。二、方法1、原代培養(yǎng)及腺病毒-EGFP轉(zhuǎn)染：無(wú)菌條件下取大鼠骨髓用全骨髓貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，腺病毒-EGFP（MOI值300-500）轉(zhuǎn)染P0-P15代骨髓MSCs。2、胎鼠先天性脊椎裂動(dòng)物模型的建立：孕10天進(jìn)行4%維甲酸（140mg/kg）胃管給藥，利用藥物致畸方法制作先天性脊椎裂動(dòng)物模型。3、干細(xì)胞移植：利用胎仔外科方法將轉(zhuǎn)染EGFP的MSCs經(jīng)纖細(xì)玻璃針注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中，并存活至20天，剖宮取胎。4、冰凍連續(xù)切片計(jì)數(shù)移植細(xì)胞的存活數(shù)量：取20天先天性脊椎裂胎鼠的脊椎，固定脫水后做冰凍切片，計(jì)數(shù)脊髓中綠色熒光細(xì)胞數(shù)量及分布情況。5、免疫熒光方法檢測(cè)移植細(xì)胞的分化情況：免疫熒光方法檢測(cè)脊髓冰凍切片中EGFP陽(yáng)性MSCs中Nestin、NF、GFAP、Myod的表達(dá)。結(jié)果1、細(xì)胞濃度流式細(xì)胞儀鑒定全骨髓細(xì)胞懸液貼壁法得到MSCs純度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，干細(xì)胞的純度越高。2、孕鼠及胎鼠存活率被移植孕鼠共86只，術(shù)后存活并得到脊柱裂標(biāo)本的孕鼠共81只，孕鼠存活率94%。每只孕鼠平均移植2-3只胎鼠，最后存活的胎鼠比例為78%。3、細(xì)胞存活情況通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)數(shù)分析，移植MSCs的總存活率為24%。并且發(fā)現(xiàn)不同濃度MSCs、不同代數(shù)的MSCs和不同移植時(shí)間對(duì)MSCs存活率都有不同的影響：在孕16天、17天和18天時(shí)移植相同代數(shù)的MSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕16天存活率PAGEPAGE39明顯低于孕17和18天，（P﹤0.05）；在相同移植時(shí)間（16天移植MSCs），P0代MSCs存活率最低，P3-6和P10-14代無(wú)明顯差別（P﹥0.05）；移植MSCs細(xì)胞數(shù)量不同對(duì)存活率影響不大（P﹥0.05）。4、細(xì)胞分化情況免疫熒光法檢測(cè)MSCs移植到脊髓中分化情況，發(fā)現(xiàn)移植MSCs不僅分化為不同神經(jīng)細(xì)胞，包括神經(jīng)干細(xì)胞（nestin）、神經(jīng)元（Neurofilament）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）。而且可分化為肌原細(xì)胞(MyoD)。分化率在P10-14代MSCs明顯高于P3-6代MSCs，在16天移植明顯高于孕17天和18天（P﹤0.01）。結(jié)論1、提示利用胎仔外科進(jìn)行宮內(nèi)干細(xì)胞移植治療先天性脊椎裂可能是可行的辦法。2、移植MSCs可在胎鼠脊髓組織中分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和肌原細(xì)胞。3、P10-14代MSCs在孕16天移植可獲得較高的分化率，在本實(shí)驗(yàn)中是胚胎期移植的最佳條件。關(guān)鍵詞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；宮內(nèi)移植；先天性脊椎裂；分化；神經(jīng)元；重建。PAGEPAGE39·英文論著摘要·ObjectiveNeuraltubedefects(NTDs)arecomplexcongenitalmalformationsresultingfromfailureofcompleteneurulationduringthefourthweekofembryogenesis.SpinabifidaandAnencephalyarethemostcommonandsevereformsofNTD,withaprevalenceofabout1in1,000births,althoughthisvariesthroughouttheworld.Individualswithspinabifidahavesubstantiallyenhancedsurvivalratethankstorecentimprovementsinmedicalandsurgicalmanagement.However,thesepatientscontinuetobeatincreasedriskformorbidityandmortalitythroughouttheirlife,eventhoughvariousprenatalorpostnataltreatmentstrategieshavebeenappliedinclinic.Prenatalrepairisanacceptablefetalsurgerybutwithunprovenbenefits,updatedreportssuggestareducedincidenceofshunt-dependenthydrocephalus,aswellasanimprovementinhindbrainherniation.However,theexpectationsforimprovedneurologicaloutcomehavenotbeenfulfilledandnotallpatientsbenefitfromfetalsurgeryinthesameway.Individualswithlumbosacralspinabifidacontinuetoexperiencevaryingdegreesofmotorandsensorydysfunctionoflowerlimbsandfailureofanalandurethralsphinctersafterbirth.Fetalcellulartherapyisanotheroptionforthetreatmentofavarietyofbirthdefects.Thereareseveralperceivedadvantagesofinuterotransplantation(IUT):(1)Therapidgrowthofthefetusprovidesopportunityforengraftmentandexpansionofdonorcells,(2)theundevelopedimmunesystemofthefetuscannotrejectforeigntissues,and(3)earlytreatmentofdiseaseisbeneficialorcriticalforeffectivetreatment.Althoughtransplantationofhealthycellsintoafetusissuggestedtoofferthepotentialtotreatalargenumberofbirthdefects(havetherapeuticpotentialforalargenumberofgeneticdisorders),uptonow,itislimitedtothetreatmentofcongenitalhematologicdisordersandimmunodeficiencydiseaseOnly.Ourpreviousstudieshavedemonstratedthedefectivedevelopmentofsensoryandmotorneuronsinfetalratspinalcordwithspinabifidaaperta,andtheintrinsicneurondeficiencyisaprimaryanomalythatcoexistswiththespinalmalformationduringfetaldevelopment,whichlikelytocontributetopoorpostoperativeneuralfunction(ureaandrectalincontinienceandlegparalysis)despitesurgicalrepair.ThuswesupposedthatPAGEPAGE39treatmentbasedonneuronregenerationorreplacementshouldbeanalternativechoicetoachievebetterfunctionaloutcomeinspinabifidapatients.Concerningregenerationmedicine,mesenchymalstemcelltransplantationhasbeenwidelyusedduetotheirconvenientisolation,theirlackofsignificantimmunogenicitypermittingallogenictransplantationwithoutimmunosuppressivedrugs,theirlackofethicalcontroversy,andtheirpotentialtodifferentiateintotissue-specificcelltypeswithtrophicactivity.Basedonallthese,inthisstudyweforthefirsttimetreatedspinabifidaapertawithinuterobonemarrowderivedmesenchymalstemcell（MSCs）transplantationusingratmodel.Method1．Experimentalanimal1.1MSCsprimarycultureFortyWisterratsaging4weeks,weighting90-100gwereinvolved.AllratswereprovidedbylaboratoryofAffiliatedShengjingHospital,1.2AnimalmodelOutbredwisterratsof10-12weeksofage(250-300gm,100rats)purchasedfromanimalcenterofchinamedicaluniversitywereusedinthisstudy.2Method2.1PrimarycultureandTransfectionInsterilecondition,ratmarrowwasflushedandcellswereseededincultureflask.Passage0toPassage14ofmarrowMSCsweretransfectedbyadenovirus-EGFP(MOIvalue300-500).2.2RatcongenitalspinabifidamodelTheappearanceofvaginalplugsinthefemaleratthemorningaftermatingwastimedastheembryonicday0(E0).Spinalbifidaapertawereinducedwithasingleintragastric140g/kgretinoicacidadministrationonE10morning.2.3CelltransplantationByfetussurgeryEGFPtransfectedMSCswereinjectedtospinalcordthroughfineglassneedle.Repairpregnantrats’uterusandfeedthemuntilday20gestation.2.4CryosectionsandCountingcellsUntilday20gestation,pregnantratunderwentoperationagain.Spinalcordoffetusratswereremovedfollowingfixation,dehydration.Countcellswithgreenfluorescenceinfrozensection.2.5DifferentiationoftransplantedcellsExpressionofNestin,NF,GFAPandPAGEPAGE39MyoDintransplantedMSCsweretestedbyimmunofluorescence.Result1．FlowcytometryanalysisshowedthepurityofourcultureMSCwasincreasedwithlongerculture.2．Total86pregnantratsreceivedfetalsurgeryandmicroinjectiononE16,E17orE18,and5diedbeforeE20,81ratsweresacrificedonE20forspinesamplecollection.Theoverallsurvivalrateofratfetusafterfetalsurgerywas94%.Onaverage,2to3fetusescouldbiinjectedinonedam.Mostoftheoperatedfetus(﹥75%)couldsurviveaftertransplantation,andtotally24%oftransplantedMSCssurvivedonfetalspinalvertebrateregion.3．Thereisatendencyofhighersurvivalratewithmorecellsinjected,itisnotstatisticallysignificant(P〉0,05).ThepassagesofinjectedMSCs,onlyP0cellsshowedlowersurvivalrate,cellsinP3-6orinP10-14presentedsimilarsurvivingrate.itisnotstatisticallysignificant(P〉0,05).Thethirdfactoristhestagesoffetaldevelopment.LesseGFPpositiveMSCssurvivedonE16fetalspinalvertebratethanonE17andE18.MSCsmigratedintodifferentregionofspinalvertebrateawayfromtheinjectionsite.4．Duringthe2-4daysofdevelopment,transplantedMSCsdefferentedintovariouscelltypesofspinalvertebra,aseGFPpositiveMSCsexpressedthespecificmarkersofneuralstemcell(Nestin),neuron(neurofilament),neurogliocyte(GFAP)andmyoblast(MyoD)aftertransplantation.ConcerningtheeffectofcellpassagesonMSCsshowedhigherneuronaldifferentiationrateinP10-14cellgroupcomparedwithinP3-6cellgroup(P<0.01).DevelopmentstagesalsoaffectneualdifferentiationofMSCs,MSCssurvivedonE16spinalvertebratehavesignificantlyhigherneuronallineagemarkerexpressioncomparedwithE17andE18group(P<0.01).Conclusion1．Itisanacceptabletechniquethatwetreatedspinabididaapertawithinuterobonemarrowderivedmesenchymalstem(MSCs)transplantationusingratmodelbyfetussurgery.2．TransplantedMSCsdifferentiateintoneuralstemcell,neuron,neurogliocyteandmyoDinfetusspinalcord.PAGEPAGE393.ThebetterneuraldifferentiationobtainedinthisstudywithlongercultureMSCstransplantedontoE16ratfetus,whichisthebestconditioninfetustransplantation.KeyWordsbonemarrowmesenchymalstemcells;uterotransplantation;congenitalspinabifida;differentiation;neurons;regeneration.PAGEPAGE39·英文縮略語(yǔ)·英文縮寫英文全稱中文全稱NTDsMSCsNFGFAPMyoDFBSPBSNeuraltubedefectsMesenchymalstemcellsNeurofilamentGlialfibrillaryacidicproteinMyogenicDifferentiationAntigenfetalbovineserumphosphate-bufferedsaline神經(jīng)管畸形骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)絲膠質(zhì)纖維酸性蛋白成肌分化抗原 成肌分化抗原胎牛血清磷酸緩沖液 磷酸緩沖鹽溶液PAGEPAGE39·論文·前言神經(jīng)管畸形(neuraltubedefects,NTD)是一類發(fā)病率高且后果嚴(yán)重的出生缺陷,是神經(jīng)溝關(guān)閉形成神經(jīng)管時(shí)的缺陷，主要包括無(wú)腦、腦膨出及脊柱裂等[1,2]。由于畸形改變嚴(yán)重，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)良好的治療方法，嚴(yán)重畸形者在胚胎期死亡，畸形改變較輕的患兒生后雖然可以保住生命，但多數(shù)表現(xiàn)程度不同的神經(jīng)功能異常，包括肢體癱瘓、尿便功能障礙、智力低下等，嚴(yán)重影響患兒的生理發(fā)育和生活質(zhì)量[3-9]。因此有必要進(jìn)行NTD的動(dòng)物模型制備及詳細(xì)病理改變的研究，為進(jìn)一步探索新的治療方法奠定基礎(chǔ)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是存在于骨髓內(nèi)的一種成體干細(xì)胞,具有自我增殖、多向分化的潛能。BMSCs的發(fā)現(xiàn)為運(yùn)用細(xì)胞替代療法治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷及疾病展示了良好的前景。隨著基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)和組織工程技術(shù)的發(fā)展，利用BMSCs的多向分化潛能及其可在體內(nèi)表達(dá)多種外源基因的特性，將其作為種子細(xì)胞用于細(xì)胞治療和基因治療已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[10-13]。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法分離BMSCs，并通過(guò)腺病毒將綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)標(biāo)記到BMSCs上，同時(shí)采用維甲酸致畸法建立胎鼠先天性脊柱裂模型，結(jié)合胎仔外科，顯微外科和顯微注射等技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞移植，觀察不同代數(shù)及濃度的BMSCs在不同階段的顯性脊柱裂胎鼠脊髓中的存活及遷移情況，并利用免疫熒光方法研究BMSCs移植后在胎鼠體內(nèi)向神經(jīng)細(xì)胞分化的情況，從而探討在胎兒期進(jìn)行干細(xì)胞移植對(duì)神經(jīng)管畸形的治療潛能。材料與方法一、材料（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BMSCs培養(yǎng)選用的4周齡Wistar鼠40只，雌雄不限，體重90-100g。動(dòng)物模型制作選用2.5-3月齡，健康Wistar雌鼠100只，體重250-300g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（二）實(shí)驗(yàn)試劑PAGEPAGE39DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司）胎牛血清（Hyclone公司）0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）青霉素，鏈霉素（華北制藥股份有限公司）腺病毒-5F35-EGFP(SinoGenoMax.Co.,Ltd,Bejing,China)橄欖油4%維甲酸（sigma公司）4%多聚甲醛10%水合氯醛一抗：兔抗大鼠GFP單克隆抗體IgG（AG279，BeyotimeInstituteBiotechnology，China）小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體IgG（MAB353,millipore）小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體IgG（MAB3402,millipore）小鼠抗大鼠NF單克隆抗體IgG（SMI-311,Abcam）小鼠抗大鼠myoD單克隆抗體IgG（BD公司）二抗：羅丹明標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(Chemicon,Millipore)羊抗兔AlexaFluor488單克隆抗體IgG（Invitrogen）DAPI核酸染劑(BeyotimeInstituteBiotechnology，China)10%血清封閉液PBS緩沖液（三）主要儀器設(shè)備CO2恒溫培養(yǎng)箱（Heraeus）超凈工作臺(tái)（Haier）熒光倒置顯微鏡(NikonEdipseE800)激光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司的TCS-SP2型)離心機(jī)（5810R,Eppendorf）顯微外科手術(shù)器材(NarishigeScientificInstruments.Tokyo,Japan)PAGEPAGE39二、方法（一）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs體外培養(yǎng)及純化取4周齡Wistar大鼠,無(wú)菌條件下取大鼠股骨，用20mlDMEM/F12(1∶1)+10%胎牛血清（FBS）細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，制作骨髓細(xì)胞懸液,全骨髓貼壁法分離BMSCs,37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)細(xì)胞為原代（P0代。）2～3d半量換液，5～7d后傳代，此時(shí)為第一代（P1代）。以后細(xì)胞每融合達(dá)80%時(shí)傳一代，直至P15代。綠色熒光蛋白標(biāo)記干細(xì)胞將干細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6孔板，轉(zhuǎn)染腺病毒-5F35-EGFP，24小時(shí)后熒光顯微鏡下確定綠色熒光表達(dá)情況，消化，吹打，離心后，制成7000～35000個(gè)/μl濃度的eGFP-MSCs懸液用于移植。（二）動(dòng)物模型的建立雌性Wistar大鼠100只（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）體重250～300克。雌雄（比例4：1）交配后，清晨陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子既定為孕0天（E0d），在E10d給維甲酸致畸，維甲酸（40mg/ml）溶于橄欖油中，以劑量為140mg/kg給藥，經(jīng)胃管注入。分別在大鼠孕16d、17d、18d時(shí)，進(jìn)行干細(xì)胞移植。實(shí)驗(yàn)根據(jù)移植時(shí)間分3組：16d、17d、18d組。（三）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植及實(shí)驗(yàn)分組1、移植分組：（1）將P3-6代細(xì)胞在不同時(shí)間移植，分孕16d、17d、18d三個(gè)組。（2）在孕16天移植不同代數(shù)BMSCs，分P0、P3-6和P10-14三個(gè)組。（3）在孕16天移植不同細(xì)胞數(shù)BMSCs，分1000-2000、2000-4000和4000-6000三個(gè)組。2、移植：孕鼠給予10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉。腹壁清理及消毒，無(wú)菌操作下依次打開(kāi)腹壁，宮壁，羊膜囊，在手術(shù)顯微鏡下暴露顯性脊柱裂胎鼠腰骶部。確認(rèn)畸形后，經(jīng)微量注射器注入0.2μl（大約2000-4000個(gè)eGFP-MSCs）細(xì)胞懸液?？p合宮壁及關(guān)閉腹腔，待麻醉清醒后送回籠內(nèi)飼養(yǎng)。（四）標(biāo)本制作及陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)PAGEPAGE39妊娠20天孕鼠再次麻醉后剖腹產(chǎn)取出經(jīng)過(guò)干細(xì)胞移植的胎鼠，將胎鼠脊柱標(biāo)本取出，放入4%多聚甲醛液體中固定，24小時(shí)后20%蔗糖脫水，24小時(shí)后取出，-80℃凍存。脊髓標(biāo)本（OCT）包埋后，冰凍，取橫斷面連續(xù)切片，厚度30μm。同時(shí)熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)切片內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，累計(jì)每根脊髓的陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)。并且觀察（五）免疫熒光染色法觀察移植干細(xì)胞在胎鼠脊髓中分化的情況1、選片：已經(jīng)確定eGFP陽(yáng)性的MSC切片用PBS洗3次，每次5分鐘。2、修復(fù)：檸檬酸修復(fù)液中加熱至90℃3、加一抗：冷卻后，PBS洗2次，10%血清封閉30分鐘，不同移植天數(shù)的切片上的分別加上小鼠抗大鼠Nestin（1：100）、NF（1：500）、GFAP（1：200）、myoD（1：100）單克隆抗體，然后在每張片子上加兔抗大鼠GFP（1：200）單克隆抗體，陰性對(duì)照不加一抗，4℃4、清洗：次日，切片PBS洗3次，每次5分鐘。5、加二抗：避光條件下加二抗：羅丹明標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1：200稀釋）4℃孵育一小時(shí)。羊抗兔AlexaFluor488單克隆抗體IgG6、核染及觀察結(jié)果：PBS洗一次，加DAPI核酸染劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用雙盲法，計(jì)數(shù)資料以±S表示，細(xì)胞存活率及分化率采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.試驗(yàn)結(jié)果一、MSCs的濃度測(cè)定經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定P0代的干細(xì)胞純度60%，P1代的純度在80-90%，P2-P15代均在90%以上。PAGEPAGE39圖1，細(xì)胞濃度趨勢(shì)，P0代干細(xì)胞的純度為60%，P1代為90%，P10代為96%。二、移植后孕鼠及胎鼠的存活率（一）孕鼠存活率移植孕鼠共86只，術(shù)后存活并得到脊柱裂標(biāo)本的孕鼠共81只，孕鼠存活率94%（81/86）。（二）胎鼠存活率每只孕鼠平均移植2-3只胎鼠，共移植胎鼠174只，獲得先天性脊椎裂胎鼠脊髓136個(gè)，移植后胎鼠的存活率是78.1%（136/174）。但不同孕齡的胎鼠存活率也不同，孕16天﹤17天﹤18天，（表1，圖2）。表1，三組孕齡胎鼠移植后的存活率（%）E16E17E18總數(shù)移植胎數(shù)1203123174存活胎數(shù)912520136存活率75.8%80.6%*87.0%**78.1%*P<0.05vsE16**P<0.01vsE16andE17PAGEPAGE39圖2，三組孕鼠移植后胎鼠存活率的趨勢(shì)表達(dá)三、移植EGFP-BMSCs存活情況（一）移植BMSCs在胎鼠體內(nèi)的存活情況(表2.1-3,圖3.1-3)每個(gè)脊髓中注射的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多少不等，范圍在102-3171個(gè)之間。經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)106根脊髓里共移植227568個(gè)EGFP細(xì)胞，共存活了56328個(gè)?？傆?jì)移植BMSCs的存活率為24%（56328/227568）。觀察三組胎鼠移植后干細(xì)胞存活率的差異，發(fā)現(xiàn)影響干細(xì)胞存活的因素有三種：1、孕齡的差異發(fā)現(xiàn)在孕17天時(shí)進(jìn)行干細(xì)胞移植干細(xì)胞的存活數(shù)量最多，即E16﹤E18﹤E17，（表2.1，圖3.1）。2、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的差異在相同移植時(shí)間（16天移植MSCs），P0代MSCs存活率最低，P3-6和P10-14代無(wú)明顯差別（表2.2，圖3.2）。3、注射細(xì)胞濃度的差異注射的細(xì)胞數(shù)越多存活的細(xì)胞也越多，1000-2000﹤2000-4000﹤4000-6000。（表2.3，圖3.3）（二）BMSCs在脊髓內(nèi)的遷移與分布（圖3.4）MSCs存活位置遠(yuǎn)離注射位置，可見(jiàn)移植細(xì)胞有遷移現(xiàn)象，有的位于缺損的脊髓內(nèi)，有的位于神經(jīng)節(jié)內(nèi)，還有一些位于皮下。PAGEPAGE39在不同部位存活的干細(xì)胞其形態(tài)也不同，有的為圓形或橢圓形，有的為長(zhǎng)梭形，伸出一個(gè)或多個(gè)突起，也可為不規(guī)則形（圖3.4）。表2.1，不同孕齡對(duì)移植干細(xì)胞存活率的影響孕齡E16E17E18干細(xì)胞存活率22.76%38.7%*34.6%**p<0.05vsE16有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖3.1，移植干細(xì)胞在三組胎鼠中的存活趨勢(shì)表達(dá)（*P<0.05vsE16）表2.2，不同代數(shù)干細(xì)胞移植后其存活率的差異細(xì)胞代數(shù)P0P3-6P10-15存活率10.79%22.57%20.10%P﹥0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PAGEPAGE39圖3.2，用不同代數(shù)干細(xì)胞進(jìn)行移植，細(xì)胞的存活率不同，表2.3，不同細(xì)胞濃度移植后的存活率注射細(xì)胞數(shù)1000-20002000-40004000-6000細(xì)胞存活率17.82%22.24%24.18%P﹥0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖3.3，不同細(xì)胞數(shù)移植同一孕齡的胎鼠后存活率的趨勢(shì)分析，(P﹥0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)PAGEPAGE39圖3.4，移植干細(xì)胞分別存活于脊髓內(nèi)（圖A;圖B，箭頭指示長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形細(xì)胞）；神經(jīng)節(jié)內(nèi)（圖C，箭頭指向圓形細(xì)胞）；皮下（圖D箭頭指向皮下存活扁平細(xì)胞）.四、移植EGFP-BMSCs分化情況（一）分化方向的表達(dá)（圖4.1-4）移植的BMSCs在先天性脊柱裂胎鼠脊髓中出現(xiàn)分化。經(jīng)免疫熒光染色證實(shí)，存活在脊髓內(nèi)的可分化為神經(jīng)干細(xì)胞(Nestin)(圖4.1)、神經(jīng)元(Neurofilament)(圖4.2)、和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)（圖4.3）、存活在肌肉內(nèi)的還可向肌細(xì)胞方向分化（成肌調(diào)節(jié)因子myoD）（圖4.4）。（二）分化率的差異（表3.1-2，圖4.5-6）1、孕16天注射的三組細(xì)胞，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分化率表現(xiàn)出明顯不同，發(fā)現(xiàn)P10-14代的分化率較P3-6代的增高。P﹤0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3.1，圖4.5).2、在孕16、17、18天同時(shí)移植的P3-6代干細(xì)胞分化率也不相同，尤其孕16天較17和18天相比明顯增加，P﹤0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3.2，圖4.6)。PAGEPAGE39圖4.1，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化，圖A，eGFP陽(yáng)性表達(dá);圖B，nestin陽(yáng)性表達(dá)；圖C，為eGFP/Nestin/DAPI的疊加表達(dá)；圖D為200倍鏡下雙陽(yáng)細(xì)胞的組織中的表達(dá)。圖4.2，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，圖A.eGFP-MSC陽(yáng)性表達(dá);圖B.NF陽(yáng)性表達(dá)；圖C.eGFP/NF/DAPI雙陽(yáng)疊加表達(dá)；圖D.eGFP/NF/DAPI,200倍鏡下雙陽(yáng)細(xì)胞的組織中的表達(dá)。PAGEPAGE39圖4.3，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，圖A.eGFP-MSC陽(yáng)性表達(dá);圖B.GFAP陽(yáng)性表達(dá)；圖C.DAPI陽(yáng)性表達(dá)；圖D.eGFP/GFAP/DAPI,200倍鏡下雙陽(yáng)細(xì)胞的組織中的表達(dá)。圖4.4，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肌細(xì)胞方向分化，圖A.eGFP-MSC陽(yáng)性表達(dá);圖B.MyoD陽(yáng)性表達(dá)；圖C.DAPI陽(yáng)性表達(dá)；圖D.eGFP/MyoD/DAPI，PAGEPAGE39200倍鏡下雙陽(yáng)細(xì)胞的組織中的表達(dá)。表3.1，不同代數(shù)干細(xì)胞移植后的分化率P3-P6P10-P14Nestin13.9%(73/523)19.2%(61/318)*Neurofilament8.9%(52/593)16%(20/124)*GFAP27.2%(44/162)33%(28/84)**P<0.01vs.P3-P6group圖4.5，不同代數(shù)的干細(xì)胞在孕16天分化為Nestin,NF,和GFAP的分化率的趨勢(shì)分析。表3.2，不同孕齡移植的P3-P6干細(xì)胞存活率%(PC/total)E16E17E18Nestin13.9%(73/523)*8.3%(24/288)**7.6%(9/117)Neurofilament8.9%(52/593)*7.6%(16/201)**5.7%(11/194)GFAP27.2%(44/162)*16.8%(13/77)17%(98/577)*P<0.01vs.E17andE18group.**P<0.01vs.E18group.PAGEPAGE39圖4.6，E16,E17和E18天移植的干細(xì)胞分化為Nestin,NF和GFAP的分化趨勢(shì)。因此在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中雖然孕16天移植干細(xì)胞的存活率較低，但其分化率確最高，是神經(jīng)元替代治療最佳的選擇。討論先天畸形每年的出生率達(dá)5%，神經(jīng)管畸形占有其中很大比例，是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的先天畸形之一[28,29]。因此先天畸形的早期診斷和治療是具有重要意義的。雖然目前神經(jīng)管畸形的產(chǎn)前診斷的技術(shù)日益提升，但是產(chǎn)前治療確不盡人意。葉酸有利于預(yù)防神經(jīng)管畸形的作用早在1990年就曾有人報(bào)道過(guò)[30]。然而，葉酸在孕期的預(yù)防知識(shí)普及并不理想，同時(shí)較高的意外懷孕率，這些都意味著目前產(chǎn)前預(yù)防的重要性未引起足夠重視。脊膜膨出或無(wú)腦畸形仍然是產(chǎn)前能夠檢查出的常見(jiàn)先天畸形之一[31,32]。目前脊柱裂的治療也仍不理想[3、4、6、7、8、9]。目前，先天性神經(jīng)管畸形在治療方面尚無(wú)突破性進(jìn)展，這主要是由于神經(jīng)損傷的恢復(fù)是極其困難的[14-18]。探索新的更有效的治療方法是目前的當(dāng)務(wù)之急。我們利用神經(jīng)示蹤、顯微外科和胎仔外科相結(jié)合的技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)先天性脊柱裂鼠支配肛門外括約肌和肛提肌的脊髓運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少[19]。因此神經(jīng)系統(tǒng)損傷后進(jìn)行細(xì)胞替代治療為該病提供了一個(gè)新的治療思路。近年來(lái)研究表明，干細(xì)胞可在損傷的脊髓中存活，并分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，PAGEPAGE39能減少損傷造成的神經(jīng)功能損失[20]。MSC有望成為一種新的細(xì)胞治療和基因治療的靶細(xì)胞作用于神經(jīng)系統(tǒng)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞一旦死亡或缺損就無(wú)法再生，如今這一觀念已開(kāi)始動(dòng)搖，研究表明，MSC可以重建中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。Azizi等將人MSC用熒光素標(biāo)記后，注入大鼠紋狀體中，分別于5、14、30、72天后取腦部冰凍切片，選擇有熒光素標(biāo)記的部分組織作免疫組化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有20%的供體細(xì)胞成活，分化為神經(jīng)樣和星形膠質(zhì)細(xì)胞。Chopp等多次將骨髓MSC應(yīng)用于腦外傷或腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，發(fā)現(xiàn)植入的MSC約1%分化為神經(jīng)元，5-8%分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并明顯促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[21-25]。MSC移植治療脊髓病變的移植方式很多，主要包括直接移植法、經(jīng)腦脊液注入移植法、靜脈注入移植法和腹腔移植法等[26-27,37,38]。直接移植法是將體外分化增殖后的MSC連同培養(yǎng)液多靶點(diǎn)直接注射的脊髓病變及其周圍；經(jīng)腦脊液注入移植法經(jīng)MSC經(jīng)靜脈注入蛛網(wǎng)膜下腔，使之隨腦脊液到達(dá)病變部位；經(jīng)靜脈注入移植是將MSC經(jīng)靜脈注入，隨血液循環(huán)通過(guò)血-脊髓屏障到達(dá)病變部位。但目前尚不清楚何種移植方式更合適，人們多采用直接移植法[26-27,37]。Inoue等將MSC經(jīng)靜脈注入脫髓鞘處理的脊髓損傷模型的成鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植的MSC可促進(jìn)髓鞘再生和脊髓的自我修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腦脊液注入移植不但能提高移植細(xì)胞在損傷脊髓內(nèi)的分化率，而且可避免直接移植造成正常組織損傷和經(jīng)靜脈注入移植導(dǎo)致的移植細(xì)胞通過(guò)血-脊髓屏障數(shù)量有限和免疫反應(yīng)較強(qiáng)的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中我們利用胎仔外科、顯微外科和顯微注射技術(shù)進(jìn)行脊髓局部注射移植，可將細(xì)胞直接送到病變部位，讓胎鼠在子宮內(nèi)進(jìn)行自行修復(fù)，其脊髓發(fā)育微環(huán)境更有利于移植細(xì)胞的存活、遷移和分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞在體內(nèi)部分存活，形態(tài)發(fā)生很多變化，有的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，類似神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞，伸出一個(gè)或多個(gè)突起，也可見(jiàn)不規(guī)則形。免疫熒光證實(shí)，在MSC移植后3-4天，MSC表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物Nestin、NF及GFAP，說(shuō)明已經(jīng)向神經(jīng)細(xì)胞分化。MSC向神經(jīng)細(xì)胞分化及進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制目前尚不明確，可能與以下因素有關(guān)。首先是替代作用，PAGEPAGE39MSC移植后向病變組織滲透、融合，部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的表面標(biāo)志，替代受損細(xì)胞，重建神經(jīng)環(huán)路。在脊髓受損部位，移植的MSC聚集，彌合了脊髓之間的中斷，分化的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)形成明顯的樹(shù)突，可能通過(guò)與神經(jīng)細(xì)胞建立廣泛的傳入和傳出聯(lián)系重建神經(jīng)通路、進(jìn)行髓鞘再生而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[38-40]。有報(bào)道MSC在體內(nèi)還有遷移的特性，無(wú)論局部移植還是經(jīng)血管移植，MSC可向損傷區(qū)域聚集[41]。MSC通過(guò)靜脈注入后，到達(dá)實(shí)質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞多達(dá)幾萬(wàn)個(gè)，但只有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的特異表型。即使表達(dá)這些蛋白表型也并不真正表明已經(jīng)有神經(jīng)細(xì)胞的功能，因此組織的替代作用有待進(jìn)一步研究[42]。另一個(gè)較合理的解釋是MSC通過(guò)分泌一些因子和神經(jīng)組織相互作用，激活細(xì)胞的修復(fù)再生機(jī)制。試驗(yàn)表明MSC能夠產(chǎn)生NT-3,VEGF,NGF,BDNF及其他營(yíng)養(yǎng)因子，然后通過(guò)這些細(xì)胞因子的共同作用（而不是某一個(gè)因子）改變損傷局部的微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的增值、分化和遷移，從而恢復(fù)大腦或脊髓組織的功能。還有學(xué)者認(rèn)為，MSC可以激活休眠的神經(jīng)元，發(fā)揮功能代償作用。MSC通過(guò)以表達(dá)骨形態(tài)蛋白，解除局部對(duì)神經(jīng)干的抑制，使之增值和分化?？傊?，MSC移植促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的移植細(xì)胞與宿主相互作用的過(guò)程[38-44]。我們成功的將MSC在宮內(nèi)移植入胎鼠體內(nèi)，手術(shù)的成功率是78%，干細(xì)胞的存活率是24%，因此我們認(rèn)為此項(xiàng)技術(shù)可作為神經(jīng)管畸形產(chǎn)前治療的方法之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，最佳的移植時(shí)間是將P10-14代MSC在母鼠孕16天時(shí)直接移植入顯性脊柱裂胎鼠脊髓內(nèi)，此時(shí)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的比率為19.2%，神經(jīng)元是16%，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是33%（圖4.5，4.6）。MSC在大鼠及新生鼠體內(nèi)移植后向神經(jīng)方向分化在以往的研究中早有報(bào)道，在給大鼠移植術(shù)后28天觀察神經(jīng)元的分化率只有3%[33]。而另一項(xiàng)研究在大鼠移植術(shù)后12天觀察未發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)元的分化[34]。然而我們的結(jié)果證實(shí)宮內(nèi)移植術(shù)后4天神經(jīng)元的分化率就以達(dá)到16%。這意味著在胎兒期進(jìn)行移植，干細(xì)胞的增值與分化的速度是相當(dāng)快的，可見(jiàn)胚胎環(huán)境對(duì)移植細(xì)胞的分化十分有利。在試驗(yàn)中還觀察到MSC還可向肌肉方向分化，通常在成年大鼠的干細(xì)胞移植試驗(yàn)中，術(shù)后要觀察2-3個(gè)月才能看見(jiàn)干細(xì)胞向肌肉方向分化[35,36]，這預(yù)示著先天性脊柱裂肌肉組織缺陷的修復(fù)在干細(xì)胞移植后也有可能實(shí)現(xiàn)，而這一點(diǎn)是脊柱裂治療中重要的部分。PAGEPAGE39因?yàn)榧怪烟ナ笤谏笫遣荒艽婊畹?，本?shí)驗(yàn)沒(méi)有移植后的長(zhǎng)期觀察結(jié)果，目前結(jié)果證實(shí)了宮內(nèi)移植MSC確實(shí)是脊柱裂胎鼠神經(jīng)元替代治療的可行辦法。胎兒外科脊髓修補(bǔ)術(shù)和我們的胎兒期宮內(nèi)干細(xì)胞移植的目的都是在懷孕早期進(jìn)行治療，以減少先天畸形的進(jìn)一步病變。但不同的是，胎兒外科是組織缺陷的修補(bǔ)，而宮內(nèi)干細(xì)胞移植是神經(jīng)元的再生。在過(guò)去的8年里有330例應(yīng)用胎兒外科技術(shù)進(jìn)行脊髓修補(bǔ)，在一定程度上是減少的出生缺陷率，但在長(zhǎng)期的隨防觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病例其感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)并不理想[4]，而本實(shí)驗(yàn)意在神經(jīng)元的替代治療從而改善感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能，和胎兒外科技術(shù)相比較而言，宮內(nèi)注射干細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)傷更小，且應(yīng)用時(shí)機(jī)更早。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)是在孕16天，17天和18天進(jìn)行移植，結(jié)果顯示雖然孕16天移植的細(xì)胞的存活率較低，但是其向神經(jīng)方向的分化率確是最高。如果移植時(shí)間能夠向前提到孕14天或15天，那么對(duì)脊柱裂生后感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)會(huì)更加有利，在進(jìn)一步的研究中我們將重點(diǎn)研究神經(jīng)功能恢復(fù)的長(zhǎng)期觀察?？傊?，在本實(shí)驗(yàn)中，我們首次建立了結(jié)合胎兒外科，顯微外科及顯微注射技術(shù)相結(jié)合的方法，宮內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，治療顯性脊柱裂。利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能，實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)元替代的早期治療。但在目前所取得的研究成果多數(shù)局限于動(dòng)物模型，MSC移植后能在體內(nèi)移行并分化成神經(jīng)樣細(xì)胞，這些細(xì)胞是否具有神經(jīng)細(xì)胞的功能，能否與其他細(xì)胞形成突觸聯(lián)系，還需從形態(tài)學(xué)及電生理等方面進(jìn)一步研究。如何提高存活率及分化率，如何進(jìn)一步提高軸突的再生能力并引導(dǎo)軸突向合適的目標(biāo)方向生長(zhǎng)，也是有待解決的問(wèn)題。相信隨著研究的不斷深入和上述問(wèn)題的解決，先天性脊椎裂的治療手段會(huì)有重大突破。結(jié)論1、提示移植后胎鼠的存活率是78.1%，利用胎仔外科進(jìn)行宮內(nèi)干細(xì)胞移植治療先天性脊椎裂可能是可行的辦法。2、移植MSCs可以在胎鼠脊髓組織中分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和肌原細(xì)胞。3、P10-14代MSCs在孕16天移植可獲得最高分化率，在本實(shí)驗(yàn)中是胚胎期移植的最佳條件。PAGEPAGE39本研究創(chuàng)新之處本研究首次將顯微外科、顯微注射、胎仔外科等技術(shù)相結(jié)合，對(duì)先天性脊柱裂胎鼠進(jìn)行MSC移植治療，并對(duì)其在脊髓內(nèi)的存活率和分化率進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。目前，先天性神經(jīng)管畸形在治療方面尚無(wú)突破性進(jìn)展，治療方法主要是應(yīng)用胎兒外科技術(shù)進(jìn)行脊髓修補(bǔ)術(shù)，但效果并不理想。本研究提出在胎兒期進(jìn)行干細(xì)胞移植治療先天性脊柱裂，利用其在胚胎發(fā)育過(guò)程中有利于分化的微環(huán)境，促進(jìn)移植的干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。參考文獻(xiàn)Elwood,J.M.,Little,J.&Elwood,J.H.,EpidemiologyandControlofNeuralTubeDefects.[M]OxforduniversityPress(1992).Zhu,L.andLing,H.,NationalNeuralTubeDefectsPreventionPrograminChina.FoodNutrBull29(2Suppl),S196(2008).Kohl,T.etal.,Percutaneousfetoscopicpatchcoverageofspinabifidaapertainthehuman--earlyclinicalexperienceandpotential.FetalDiagnTher2006.21,185-193Fichter,M.A.etal.,Fetalspinabifidarepair--currenttrendsandprospectsofintrauterineneurosurgery.FetalDiagnTher2008.23,271-286Yuan,Z.etal.,Constipationisassociatedwithspinabifidaoccultainchildren.ClinGastroenterolHepatol2008Dec;6(12):1348-53ACOGpracticebulletin.Clinicalmanagementguidelinesforobstetrician-gynecologists.Number44,July2003.(ReplacesCommitteeOpinionNumber252,March2001).ObstetGynecol.2008Oct;112(4):951-61.Hirose,S.,Farmer,D.L.,andAlbanese,C.T.,Fetalsurgeryformyelomeningocele.ClinPerinatol.2009Jun;36(2):431-8,xi.ReviewSutton,L.N.,Fetalsurgeryforneuraltubedefects.BestPractResClinObstetGynaecol(2008).22(1),175.Rintoul,N.E.etal.,Anewlookatmyelomeningoceles:functionallevel,vertebrallevel,shunting,andtheimplicationsforfetalintervention.Pediatrics2002Mar;109(3):409-13.Muench,M.O.andBarcena,A.,Stemcelltransplantationinthefetus.CancerControl2004.11,105-118.PAGEPAGE39Roybal,J.L.,Santore,M.T.,andFlake,A.W.,Stemcellandgenetictherapiesforthefetus.SeminFetalNeonatalMed(2009).Merianos,D.,Heaton,T.,andFlake,A.W.,Inuterohematopoieticstemcelltransplantation:progresstowardclinicalapplication.BiolBloodMarrowTransplant2008.14,729-740.Muench,M.O.,Inuterotransplantation:babystepstowardsaneffectivetherapy.BoneMarrowTransplant2005.35,537-547.Guan,K.e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·附錄·綜述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在移植治療中的示蹤方式研究生：馬麗麗導(dǎo)師：袁正偉摘要：具有多向分化潛能的干細(xì)胞在損傷組織的修復(fù)再生方面已經(jīng)表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景，自體干細(xì)胞和基因修飾的干細(xì)胞已經(jīng)成功應(yīng)用于動(dòng)物試驗(yàn)和臨床治療中。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能【1】。間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為肝卵圓細(xì)胞、肝細(xì)胞【2】、膽管細(xì)胞【3】、神經(jīng)元【4】、骨骼肌細(xì)胞【5】和上皮細(xì)胞【6，7】等多種組織細(xì)胞。由于移植的干細(xì)胞在不同組織的微環(huán)境作用下遷移和分化的方式也不同，為了研究干細(xì)胞在不同組織中遷移和分化規(guī)律，移植細(xì)胞在損傷組織和器官中準(zhǔn)確定位具有極其重要意義。因此，近年來(lái)各種細(xì)胞追蹤技術(shù)被應(yīng)用于不同研究中，包括BrdU、熒光染料、綠色熒光蛋白、MRI、同位素標(biāo)記和其他方式。然而，由于試驗(yàn)?zāi)康牟煌透杉?xì)胞的不同特征在干細(xì)胞的移植試驗(yàn)中標(biāo)記的方式也不同。本文將應(yīng)用于基礎(chǔ)試驗(yàn)和臨床前期試驗(yàn)的各種追蹤方式和在干細(xì)胞移植中的應(yīng)用做了總結(jié)。關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植示蹤1.溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，BrdU）：BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，可與內(nèi)源性胸腺嘧啶核苷競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入細(xì)胞S期的核酸序列，與摻入細(xì)胞的機(jī)制相似，因此，作為反映細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)確切可靠，常被應(yīng)用于活體組織細(xì)胞的檢測(cè)【8】。細(xì)胞增殖周期包括Gl,S,PAGEPAGE39G2和M4個(gè)時(shí)期，S期是DNA合成期，細(xì)胞內(nèi)DNA進(jìn)行半保留復(fù)制，各種構(gòu)成DNA的原料摻入到DNA中。BrdU作為一種DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期而同時(shí)又有BrdU存在時(shí)，就會(huì)有BrdU摻入新合成的DNA中，只要細(xì)胞不死亡，這種BrdU在細(xì)胞核的DNA中將長(zhǎng)期存留。有報(bào)道認(rèn)為，標(biāo)記BrdU的細(xì)胞只要不受紫外線照射，對(duì)細(xì)胞即無(wú)功能損害。近年來(lái)，國(guó)外已有學(xué)者將該技術(shù)應(yīng)用到跟蹤檢測(cè)移植細(xì)胞的成活、分化和功能狀態(tài)。Kopeal等曾用BrdU標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）并將其移植到新生鼠的側(cè)腦室。12天后，他們?cè)诒灰浦彩蟮那澳X和小腦內(nèi)觀察到了被BrdU標(biāo)記的BMSCs，并且一些BMSCs已經(jīng)分化為成熟的星型細(xì)胞【9】。BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也曾經(jīng)被移植在小腦缺血的動(dòng)物模型中，結(jié)果顯示被標(biāo)記的細(xì)胞不僅能夠遷移到缺血組織的中心而且還轉(zhuǎn)化成為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞【10】。然而，在最近的研究中有人給用環(huán)磷酰胺和粒細(xì)胞刺激因子進(jìn)行刺激的新生鼠和成年鼠給予4-10天BrdU移植，停藥后觀察70天。在實(shí)驗(yàn)中觀察到，不足6%造血干細(xì)胞BrdU陽(yáng)性，而在被BrdU標(biāo)記的造血細(xì)胞中造血干細(xì)胞不到0.5%。他們的結(jié)果表明隨著細(xì)胞的分裂BrdU做為造血干細(xì)胞的標(biāo)記物其特異性和敏感性較低，也就是標(biāo)記強(qiáng)度會(huì)降低或標(biāo)記丟失。并且移植的BrdU標(biāo)記細(xì)胞在其死亡后，能將BrdU釋放出來(lái)，并被臨近的細(xì)胞攝取，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性【10，11】。盡管在心肌、皮膚、神經(jīng)和肝臟疾病中進(jìn)行干細(xì)胞移植時(shí)已經(jīng)應(yīng)用過(guò)BrdU標(biāo)記細(xì)胞，但在組織中移植后存留的帶標(biāo)記的細(xì)胞中干細(xì)胞純度至今沒(méi)有得到驗(yàn)證【11-14】。2.熒光染料技術(shù)（FluorsentDye）：應(yīng)用于細(xì)胞示蹤的熒光染料有很多種，包括CM-DiI、CFSE、hochst33342、DAPI和PKH26。在這些染料中CM-DiI有45%-70%的細(xì)胞毒性并且在標(biāo)記后