DNA分子熒光探針

PAGE2DNA分子熒光探針DNA是生命遺傳的重要物質(zhì)，DNA分子的定量分析、特異識別，對基因組學、病毒學、分子生物學等相關(guān)學科的發(fā)展具有十分重要的意義。由于生物分子自身的熒光較弱，目前多采用熒光探針法檢測。熒光探針法較傳統(tǒng)的同位素檢測快速，重復性好，用樣量少，無輻射，在DNA自動測序，抗體免疫分析，疾病診斷，抗癌藥物分析等方面已得到廣泛應(yīng)用[1,2]。DNA熒光探針的靈敏度是影響檢測結(jié)果的重要因素，因而開發(fā)出更靈敏的熒光探針，同時避免生物熒光背景的干擾已成為目前研究的熱點。下面對DNA分子熒光探針的結(jié)構(gòu)、功能及對DNA的分析應(yīng)用技術(shù)方面作一介紹。1吖啶、菲啶類吖啶、菲啶類染料是應(yīng)用最早的核酸探針，它們通過嵌入或靜電吸引與DNA分子結(jié)合，使DNA的熒光大大增強，是序列非特異的小分子探針。吖啶的基本結(jié)構(gòu)為二苯并吡啶，在水溶液中呈弱堿性。1940年，發(fā)現(xiàn)當吖啶橙與酸性物質(zhì)吖啶橙連接或存在于酸性物質(zhì)中時，其特征光譜會發(fā)生一定的變化，至此一直被用于生物體的染色。吖啶橙可與DNA或RNA作用，與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合后的熒光激發(fā)/發(fā)射波長分別為502/538nm（水）[3]。為提高染料穩(wěn)定性及熒光強度，大量的吖啶衍生物被合成。Pavel等[4]合成了系列硫代吖啶，并用毛細管液相色譜對其定量純化分析。Naofumi[5]合成了10-羧甲基吖啶酯，其熒光及穩(wěn)定性都有很大提高，同時含有的羧基活性基可與生物分子共價結(jié)合。Cao等在吖啶橙給體與番紅T受體之間建立了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）定量測定DNA的方法，其中給體的最大發(fā)射波長要與受體的吸收波長重疊，對小牛胸腺DNA的檢測限為2.6×10-7molL-1[6]。該法雖然靈敏度較高，但易受到牛血清白蛋白和人血清白蛋白的干擾。一些吖啶的絡(luò)合物，會對小溝及DNA序列特異識別，有望成為DNA的轉(zhuǎn)錄抑制劑，控制核酸的表達[7,8]。對位氨基取代的喹吖啶化合物對三鏈DNA有高度的穩(wěn)定作用及選擇性，而且該類化合物表現(xiàn)出光活性，成為DNA的光切斷劑[9]。溴乙錠是應(yīng)用較廣的菲啶類探針，溴乙錠可結(jié)合單鏈（ssDNA）、雙鏈及多鏈DNA，與核酸結(jié)合后，熒光增強20～30倍，激發(fā)波長紅移30～40nm，發(fā)射波長發(fā)生藍移，Stokes位移較大。雙嵌入劑乙錠均二聚物（Ethidiumhomodimer，EthD）的嵌入部分使染料分子與DNA之間形成溴乙錠乙錠均二聚物十分牢固的親和力，連接常數(shù)約1011，（溴乙錠僅為105），同時對三鏈DNA有高親和作用，因而更利于應(yīng)用到抗體、抗癌藥物的基因水平的研究。Gherghi等[10]用汞滴電極研究了溴乙錠、吖啶橙與dsDNA的作用，結(jié)果顯示它們的作用方式是完全不同的。利用488nm氬離子激光激發(fā)和共聚焦熒光成像掃描系統(tǒng)對EthD和DNA復合物檢測，瓊脂糖凝膠電泳后，檢測靈敏度可達皮克（10-12g）級[11]。溴乙錠探針研究dsDNA與樹枝狀大分子（Dendrimer）的相互作用[12]，對于細胞修復、分子識別等基因生命學有深遠意義。富含堿基G的ssDNA可以形成分子內(nèi)四鏈結(jié)構(gòu)，溴乙錠的一些衍生物被發(fā)現(xiàn)可以增加DNA四鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并作為研究四鏈結(jié)構(gòu)的熒光探針[13]。它們的一些光譜性質(zhì)見表1[3,14,15]。2菁類染料2.1TOTO類吖啶橙、溴乙錠類染料雖然與核酸結(jié)合穩(wěn)定，但未結(jié)合的染料自身的熒光會造成高的熒光背景，干擾檢測，同時溴乙錠具有很大毒性。TOTO和YOYO是由Glazer研究組開發(fā)的一類對dsDNA具有高度親和力的不對稱菁染料[16,17]。染料在溶液中無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾。與dsDNA結(jié)合后發(fā)生強烈的熒光，熒光增強約1000倍，染料分子與DNA的堿基對最大比例可達1:4，在瓊脂糖凝膠和丙烯酰胺凝膠電泳中穩(wěn)定。它們分別由單體噻唑橙TO和噁唑黃YO通過一個多亞甲基胺柔性鏈連接成二聚體。YOYO是TOTO的類似物，只是其中用苯并噁唑替換了苯并噻唑。改變多亞甲基鏈兩端的染料分子，可以得到不同的異二聚體TOTAB、TOTIN等。該類染料還有POPO、BOBO以及不對稱單亞甲基菁染料PO-PRO、BO-PRO、TO-PRO、YO-PRO等，共軛鏈碳數(shù)增加，吸收及發(fā)射波長產(chǎn)生紅移。Rye等認為ssDNA-TOTO復合物穩(wěn)定性及光譜性質(zhì)的變化在于TOTO頭部基團與單鏈堿基之間的堆積作用和鏈上兩個陽離子正電荷與DNA骨架上的負電荷之間的庫侖力共同作用的結(jié)果[18]。TOTO可高選擇性地用于dsDNA的非序列特異性的檢測，它對所有的dsDNA表現(xiàn)出極高的親和作用，但更易嵌入dsDNA的(5′-CTAG-3′)2位，大約是100倍的選擇性，其次是(5′-CTGA-3′)2位，大約50倍的選擇性[19]。Jason等[20]用溶液粘度測定法和原子力顯微鏡解釋了TOTO與DNA的雙嵌入作用。Y=O,YOn=0,Y=S,TOTO;n=0,Y=O,YOYOTOTINY=S,TOn=1,Y=S,TOTABY=O,POY=S,BOBOn=0,Y=O,PO-PRO-1;n=0,Y=S,BO-PRO-1Y=S,BOY=O,POPOn=1,Y=O,PO-PRO-2;n=1,Y=S,BO-PRO-2與DNA的高度嵌合使這類染料熒光極大增強，廣泛用于DNA的染色。利用激光激發(fā)共聚焦熒光凝膠掃描檢測系統(tǒng)，瓊脂糖凝膠電泳，TOTO及YOYO與dsDNA復合物的檢測限是4皮克，較傳統(tǒng)的溴乙錠染色用量低500倍[21]。Zhu等[22]利用毛細管電泳分離DNA碎片，TOTO染色后靈敏度可達到每區(qū)帶2～4amol（10-18mol）堿基對。Stephan等以共聚焦掃描熒光檢測的方法，對TOTO染色過的微量DNA碎片尺寸定量分析，不同長度的DNA碎片熒光強度不同，可檢測到長度為2～14kbp（bp，指堿基對）的碎片，不確定度為7～14％。該法采用玻璃覆蓋的載片，表面涂有價格便宜的聚賴氨酸等涂層，具有很好的應(yīng)用前景[23]。YOYO-1可以作為新的DNA縮合作用探針，弱酸性（pH5.7）條件下，YOYO嵌入的單個DNA分子（～48.5kbp）被破壞成100～150nm直徑的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，用光捕捉可觀測到單個與縮合的DNA分子之間的構(gòu)象轉(zhuǎn)化，達到150ms的時間分辨[24]。Claire等[25]發(fā)現(xiàn)，在DNA存在時YO和YOYO會產(chǎn)生光漂白，其原因主要在于氧化的堿基8-氧代-7，8-二羥基-脫氧鳥嘌呤能使嵌入的YOYO熒光產(chǎn)生猝滅。TOTAB、TOTIN、噻唑橙和溴乙錠異二聚物TOED1、TOED2、熒光素和溴乙錠異二聚物FED等可用于研究能量在給體與受體之間的轉(zhuǎn)移。與dsDNA結(jié)合后，給體熒光團發(fā)射的熒光約90％被猝滅，而受體熒光團的熒光較同樣條件下的單體熒光增強100倍以上，提高了分析靈敏度。用于DNA自動序列分析中，單一波長的光源激發(fā)染料對，經(jīng)過FRET過程后，在不同波長下發(fā)射，因而實現(xiàn)了單一光源激發(fā)多色檢測。TOTO類染料雖然價格貴，但標記快速，接近生理pH條件，對生物分子的功能活性影響小。染料與dsDNA結(jié)合后的性質(zhì)見表1。表1染料與dsDNA結(jié)合后的熒光性質(zhì)Tab.1FluorescencepropertiesofdyescoupledwithdsDNA染料量子產(chǎn)率最大激發(fā)/發(fā)射波長/nm熒光增強倍數(shù)連接常數(shù)ε×10-4/Lmol-1cm-1信噪比參考文獻吖啶橙0.43502/5381.53.1×1045.3(DMSO或DMF)1.23溴乙錠0.15526/604211.5×1050.32(同上)1.33YOYO-10.52491/5094606×1089.9(同上)3.93TOTO-10.34514/53314001.1×10911.7(同上)___3TOTIN吸收波長506;547發(fā)射波長531;673367.9;14.64(甲醇)14TOTAB吸收波長507;636發(fā)射波長532;6581267.76;10.1(甲醇)14POPO-1434/4569.2(水或甲醇)15BOBO-1462/48111.4（同上）15PO-PRO-1435/4555.0(同上)15BO-PRO-1462/4815.8(同上)15ε值由DNA-染料復合物在水或甲醇中與單體染料對照的結(jié)果2.2花菁染料2.2.1花菁染料的特點嵌入式熒光染料對DNA序列不能特異識別，且其最大發(fā)射波長一般小于600nm，然而生物分子在紫外區(qū)有弱熒光，為避免生物分子的自熒光，開發(fā)近紅外熒光染料成為熱點?；ㄝ既玖系哪栁障禂?shù)大，熒光發(fā)射波長范圍寬，一般在600～1000nm的近紅外區(qū)，可大大避免生物自身的熒光背景干擾，與成本較低的激發(fā)光源如半導體激光器匹配，用于DNA自動測序、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測及抗體免疫分析等。下面是由Waggoner等開發(fā)的一類多甲川類花菁染料[26]。當中間的共軛雙鍵數(shù)n是1、2、3時，分別為CY3、CY5、CY7系列菁染料。每增加一個共軛雙鍵，最大吸收波長紅移100nm，共軛雙鍵數(shù)越多，染料越不穩(wěn)定。苯并噻唑或苯并吲哚取代吲哚環(huán)后，最大吸收發(fā)生紅移。近紅外菁染料共價標記具有特異性，標記更穩(wěn)定，貯存期長。2.2.2光穩(wěn)定性活性氧如單線態(tài)氧、超氧化物、過氧化物等氧化還原活性物質(zhì)被認為是熒光團產(chǎn)生光降解而褪色的主要原因?；ㄝ既玖系墓馄资怯捎趩尉€態(tài)氧對多亞甲基鏈的攻擊。為了提高染料的光穩(wěn)定性，常將母體中的多亞甲基鏈改變?yōu)榉剿岘h(huán)、環(huán)戊烯、環(huán)己烯等剛性環(huán)結(jié)構(gòu)，或在分子外部共價引入或摻雜環(huán)糊精等[27,28]。姚祖光等發(fā)現(xiàn)染料用含氯環(huán)己烯取代亞甲基鏈結(jié)構(gòu)并將吲哚的1位用大體積的芳環(huán)取代后，染料的光穩(wěn)定性會顯著增強[29]。2.2.3染料的標記（標記試劑的生成）將染料標記在一定序列的寡核苷酸上可獲得具有特異性的寡核苷酸探針，同時運用熒光PCR擴增技術(shù)，可得到高靈敏度的探針?；ㄝ既玖吓c寡核苷酸的共價標記位一般在吲哚環(huán)的R1位上，R1位的活性基團通過琥珀酰亞胺酯活化后，與連接臂的一端結(jié)合，連接臂的另一端與寡核苷酸的核糖或堿基共價連接。活性基團一般為含羧基的取代基，為提高染料的水溶性及穩(wěn)定性，常在吲哚環(huán)的R3、R4位引入水溶性基團，如磺酸基等。有的在R3、R4位引入活性基，而在R1、R2位引入磺酸基。也可采用鄰苯二甲酰亞胺酯或異硫氰酸酯。一般寡核苷酸的多處標記會使熒光信號增強[30]，但由于染料之間及染料與核酸間的聚集（Aggregation），多處標記后的寡核苷酸會發(fā)生一些性質(zhì)的變化，如降低了探針的穩(wěn)定性和熒光亮度。同時，寡核苷酸的尺寸很小，因此要想增強探針的靈敏度，必須考慮改變熒光團的結(jié)構(gòu)以抑制染料的聚集。連接臂的長度也會影響探針的靈敏性，連接臂過短，會影響探針的穩(wěn)定性及后面的雜交檢測。Waggoner等[31]經(jīng)過體外實驗，獲得優(yōu)化探針，即每隔6個堿基通過連接臂標記一個CY3染料。2.2.4應(yīng)用花菁染料廣泛用于DNA自動測序和核酸、蛋白質(zhì)及抗體的標記等。Duthie等[32]合成了菁染料CY5、CY5.5標記的二脫氧核糖三磷酸酯結(jié)構(gòu)用于單色DNA測序。James等[33]合成了近紅外花菁染料異氰酸酯和琥珀酰亞胺酯作為生物探針標記試劑，但酯化反應(yīng)收率及純度都很低。鄭洪等[34]以近紅外花菁染料的熒光猝滅測定核酸，測定范圍是0.08～1.2μg/mL。Yang等[35]將羧基引入近紅外花菁染料，毛細管電泳激光誘導熒光檢測，可以處理并檢測0.8amol的染料。由于染料水溶性好，需高效液相色譜（HPLC）分離，因而限制了應(yīng)用。Wellington等[36]用三步合成了穩(wěn)定性較好的近紅外菁染料NIR820（激發(fā)與發(fā)射波長分別為790和820nm）,并避免了HPLC分離,使產(chǎn)品分離能力達到克量級，解決了標記用染料的合成及純化問題,促進了生物標記試劑的發(fā)展。NIR8203熒光素和羅丹明類熒光素1是1871年由VonBayer合成的，最大吸收/發(fā)射在492/571nm（水中），量子產(chǎn)率在0.92（pH>8）[37]。由于熒光強度大，大量的熒光素衍生物被合成并用作熒光檢測試劑。如5(6)-羧基熒光素2、5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯3、5-碘乙酰胺熒光素4、熒光素異硫氰酸酯5等是應(yīng)用最廣泛的熒光衍生試劑，用于病毒學、細胞學及免疫組織化學。將熒光素共價地連接到核酸、寡核苷酸、藥物、蛋白質(zhì)及其它分子來合成探針，用于基因病毒的檢測及表達[38]。熒光素也存在一些缺點：如熒光素共軛體不穩(wěn)定，熒光測試儀的強激光，使之發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的光漂白，導致熒光信號的迅速下降。熒光素在水溶液中以離子形式存在，吸收及熒光性質(zhì)易受pH值影響。與標記物共軛連接后，易發(fā)生猝滅。Sun等[38]在熒光素分子中引入氟使其光穩(wěn)定性有很大提高并降低了離子化pH值。Gao等[39]合成了光穩(wěn)定性好的含單羧基的熒光素衍生物，其中8的穩(wěn)定性是1和BODIPYFL的10倍，但是熒光強度卻較1下降了4倍。它們的光譜性質(zhì)見表2[38]。表2熒光素的光譜性質(zhì)Tab.2Spectralpropertiesoffluoresceins熒光素衍生物吸收/發(fā)射波長/nm量子產(chǎn)率ε/Lmol-1cm-11492/517（水）0.92900002492/5160.92847006492/5170.927510/5340.5978100pH9.0磷酸緩沖溶液羅丹明染料由于分子呈剛性平面，有較高的熒光量子產(chǎn)率，故熒光較強，已成為商品化染料；但Stokes位移較小，吸收區(qū)域的低能量部分與發(fā)射區(qū)的高能量部分重疊，導致染料的激發(fā)輻射損失。常見的有羅丹明B、羅丹明6G、羅丹明101、德克薩斯紅等。Zhu等[40]合成了Phosphin3R羅丹明101羅丹明BPhosphin3R探針，該探針成本較低，是一種基于熒光猝滅來快速檢測核酸的熒光染料，最大激發(fā)/發(fā)射波長為468/505nm。核酸存在時，熒光會顯著猝滅，對小牛胸腺DNA的檢測限為5.0ng/mL，沙門桿菌的檢測限是6.0ng/mL。4噻嗪和噁嗪類染料這類染料分子結(jié)構(gòu)簡單，合成方便，但熒光量子產(chǎn)率較低，限制了應(yīng)用。主要有耐爾藍、耐爾紅和噁嗪750等。耐爾藍通過與DNA作用，染料的熒光被猝滅，通過熒光強度的減弱來檢測DNA的含量。JA242噁嗪染料與發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸端基連接形成靈敏探針（Smartprobe），雜交前被莖桿結(jié)構(gòu)處互補的鳥嘌呤殘基所高度猝滅。當與特異的靶序列結(jié)合時，發(fā)夾打開，染料與鳥嘌呤分離，熒光增強約6倍，可以檢測皮摩爾級(10-12mol)的核酸濃度[41]。耐爾藍噁嗪720JA2425BODIPY(Borondipyrromethenedifluoride)染料BODIPY染料熒光量子產(chǎn)率高，熒光波長范圍寬，可以通過調(diào)節(jié)R1、R2取代基，獲得不同的熒光發(fā)射波長，一般用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。BODIPYFL標記的G三磷酸酯核苷類似物作為G蛋白親和探針（Affinityprobe），毛細管電泳激光誘導熒光檢測，檢測限為2nmol[42]。BODIPY6其它類別探針6.1稀土元素探針稀土離子也是一類核酸探針的檢測試劑。在水溶液中僅有Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)發(fā)出熒光，與DNA配合后仍保留熒光性能，可特異識別核苷酸。Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)與一些小分子配體配合，由于配體本身性質(zhì)、中心離子-配體成鍵及溶劑等因素影響，使配合物的激發(fā)態(tài)壽命達到毫秒級，并發(fā)出窄而強的熒光。Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)與小分子的配合物探針通過共價鍵與靶DNA共價結(jié)合后多用于實時定量熒光PCR反應(yīng)產(chǎn)物的分析及雜交測試。該類探針要求稀土配合物易于合成并且足夠穩(wěn)定，同時熒光發(fā)射強度大。Nurmi等[43]用Tb(Ⅲ)和Eu(Ⅲ)標記的探針進行實時同步擴增及前列腺特異抗原的測定，信噪比要高于傳統(tǒng)的TaqMan探針，而循環(huán)閾值則降低。6.2量子點熒光探針量子點熒光探針是由ⅡⅣ族和ⅢⅤ族元素組成的半導體納米顆粒，將核酸連接到量子點的表面，做成探針，通過體外雜交常規(guī)熒光（FISH）分析，發(fā)現(xiàn)染色體的異常及變異，可取代一些有機熒光染料進行生物分子檢測。研究較多的有CdSe、CdTe、ZnS等。量子點探針可以在有機溶劑中制備，但須經(jīng)過一定的化學修飾，使其表面具有一定的水溶性基團，同時又具備一些與生物分子偶連的活性基團，因而反應(yīng)條件苛刻，步驟復雜，成本較高。盡管在水溶液中制備的成本低，但量子點的熒光產(chǎn)率低，尺寸分布較大。目前較多采用在有機溶劑中合成。在強激光下易發(fā)生光漂白，是有機類熒光染料最普遍的缺陷。量子點探針較傳統(tǒng)的有機熒光染料具有一定的優(yōu)越性。首先，熒光光譜范圍寬，通過改變納米晶體材料和尺寸，獲得激光誘導熒光光譜范圍在400nm～2μm；其次，熒光光譜范圍可調(diào)，穩(wěn)定性好，熒光壽命長，且可用單一波長的激發(fā)光源同時激發(fā)不同大小尺寸的量子點，得到不同熒光發(fā)射波長的檢測信號，相對于有機熒光染料的單一光源激發(fā)得到單一熒光發(fā)射信號，降低了實驗成本并簡化了分析步驟。1998年，Bruchez等[44]制備了CdSe-ZnS核-殼結(jié)構(gòu)的納米晶體。之后又增加了SiO2層，使其具有水溶性，同時SiO2經(jīng)過修飾后可以與生物分子結(jié)合，量子產(chǎn)率高且穩(wěn)定。Nie等[45]將量子點的表面連接上巰基乙酸，使量子點不僅具有水溶性，同時可與生物分子連接。Pathak等[46]將量子點表面用眾多的羥基修飾，解決了量子點探針雜交過程中的水溶性問題，同時降低了量子點表面大分子的非特異連接，穩(wěn)定性也大大增加。以上量子點都是在有機溶劑中合成的，林章碧等[47]以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，在水溶液中，合成了尺寸為3nm的CdTe半導體納米粒子?？傊?，量子點熒光探針用于生物熒光標示，是一個具有廣闊應(yīng)用前景的領(lǐng)域。7結(jié)語目前，DNA熒光探針要解決的問題是提高靈敏度，增強光穩(wěn)定性，降低合成成本。不同的DNA熒光探針各有優(yōu)缺點，有機類染料中近紅外染料具有一定的優(yōu)勢，尤其是近紅外菁染料將會更多的被合成并應(yīng)用于生物分子的檢測，其光穩(wěn)定性有待提高。量子點探針作為一個新興的領(lǐng)域，必將受到越來越多的重視。相信不久的將來，隨著新型、性能優(yōu)異的熒光探針的開發(fā)，人類將能夠?qū)崿F(xiàn)對一些生物過程運用多種方法、多種參數(shù)進行實時觀測、動態(tài)研究，這將極大地推動基因組學及相關(guān)學科的發(fā)展。參考文獻[1]JWRichard,MPJose,TVictor,etal.AppliedSpectroscopy,1997,51:836~843.[2]KLicha,CHessenius,ABecke,etal.BioconjugateChem.,2001,12:44~50.[3]SGurrieri,KSWells,LDJohnson,etal.Anal.Biochem.,1997,249:44~53.[4]PCoufal,ZBosáková,ETesarová,etal.J.ChromatographyB,2002,770:183~189.[5]SNaofumi.TetrahedronLett.,1996,37:8519~8522.[6]YCao,XWHe,ZGao,etal.Talanta,1999,49:377~383.[7]EKimura,HKitamura,KOhtani,etal.J.Am.Chem.Soc.,2000,122:4668~4677.[8]EJFechter,PBDervan.J.Am.Chem.Soc.,2003,125:8476~8485.[9]PMarie,PDavid,BAlexandre,etal.J.Am.Chem.Soc.,2001,123:9283~9292.[10]ICh.Gherghi,STGirousi,ANVoulgaropoulos.Talanta,2003,61:103~112.[11]GNAlexander,PKonan,ARichard.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Biochemistry,1990,87:3851~3855.[12]WChen,NJTurro,DA.Tomalia.Langmuir.,2000,16:15~19.[13]FKoeppel,JFRiou,ALaoui,etal.NucleicAcidsResearch,2001,29:1087~1096.[14]SCBenson,ZXZeng,ANGlazer.Anal.Biochem.,1995,231:247~255.[15]張華山,王紅,趙媛媛編著.分子探針與檢測試劑.北京：科學出版社,2002:322.[16]SCBenson,RAMathie,ANGlazer,etal.NucleicAcidsResearch,1993b,21:5720~5726.[17]SCBenson,PSingh,ANGlazer.NucleicAcidsResearch,1993a,21:5727~5735.[18]HSRye,ANGlazer.NucleicAcidsResearch,1995,23:1215~1222.[19]JPJacobsen,JBPedersen,LFHansen,etal.NucleicAcidsResea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