熒光分析法課件

24十二月202347-1熒光分析法

Fluorometry

第一節(jié)基本原理

第二節(jié)定量分析方法

第三節(jié)熒光光度計(jì)與其他熒光技術(shù)24十二月202353-2

概述：光致發(fā)光：是物質(zhì)吸收輻射能產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)電子以發(fā)射輻射光的形式回遷至基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。常見(jiàn)的光致發(fā)光是熒光和磷光。24十二月202353-3.

熒光：物質(zhì)從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回至基態(tài)時(shí)所發(fā)射出的光稱為熒光。熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)產(chǎn)生的熒光光譜進(jìn)行定性和定量分析的方法。

熒光分析的種類(lèi)：分子熒光、原子熒光紫外可見(jiàn)-熒光、紅外熒光、X射線熒光熒光分析特點(diǎn)：靈敏度高、選擇性好紫外可見(jiàn)檢出限10-7；熒光可達(dá)10-10/-1224十二月202353-4一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生（二）熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率（二）有機(jī)物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（三）熒光試劑三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素第一節(jié)熒光分析法的基本原理24十二月202353-5（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程電子能級(jí)的多重性：M=2S+1電子的自旋量子數(shù)：s=±?軌道的總自旋量子數(shù)：S=∑si=0，1一、分子熒光24十二月202353-6分子電子能級(jí)的多重性示意圖S*1S0T*1ππ*基態(tài)：S=0，M=2S+1=1激發(fā)態(tài)：S=0，M=2S+1=1S=1，M=2S+1=324十二月202353-7熒光：激發(fā)單線態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)回遷至基態(tài)磷光：激發(fā)三線態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)回遷至基態(tài)2、熒光與磷光的產(chǎn)生熒光與磷光的發(fā)生包括兩個(gè)過(guò)程：（1）電子能級(jí)的激發(fā)；（2）電子能級(jí)回遷——去活化系間跨越去活化主要過(guò)程24十二月202353-9（1）振動(dòng)弛豫（VibrationalRelaxation,VR）處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周?chē)姆肿樱娮訌母哒駝?dòng)能層失活至同一電子能級(jí)內(nèi)低振動(dòng)能層的過(guò)程，稱為振動(dòng)弛豫。（2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過(guò)振動(dòng)偶合產(chǎn)生無(wú)輻射回遷。去活化主要過(guò)程：六個(gè)24十二月202353-10（3）外轉(zhuǎn)換（ExternalConversion，EC）受激分子與溶劑或其它分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過(guò)程，也稱“熄滅”或“猝滅”。常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程中。24十二月202353-11（4）系間跨躍（IntersystemConversion）系間跨躍是發(fā)生在兩個(gè)不同多重態(tài)之間的無(wú)輻射躍遷，即處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過(guò)程。為無(wú)輻射躍遷，重原子或溶液中存在氧分子等順磁性物質(zhì)時(shí)容易發(fā)生。結(jié)果：熒光減弱24十二月202353-12（5）熒光發(fā)射激發(fā)態(tài)分子經(jīng)振動(dòng)馳豫回到第一電子激發(fā)態(tài)S1*的最低振動(dòng)能級(jí)，然后在很短時(shí)間（10－9～10－7s）再躍遷回基態(tài)S0的任一振動(dòng)能級(jí)時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。因振動(dòng)馳豫損失能量，發(fā)射熒光的波長(zhǎng)總是大于紫外激發(fā)光的波長(zhǎng)。24十二月202353-13（6）磷光發(fā)射經(jīng)系間跨躍從單重激發(fā)態(tài)躍遷到三重激發(fā)態(tài)高能層，再經(jīng)振動(dòng)弛豫回到三重激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能層，最后在10－4～10s內(nèi)躍遷回基態(tài)產(chǎn)生的輻射。24十二月202353-14去活化過(guò)程的歸納總結(jié)24十二月202353-15（二）熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜（熒光光譜）。1、熒光激發(fā)光譜（Excitationspectrum）改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量一定波長(zhǎng)的發(fā)射熒光的強(qiáng)度變化，記錄熒光強(qiáng)度F與激發(fā)波長(zhǎng)λex的關(guān)系曲線，即為熒光激發(fā)光譜。主要應(yīng)用：①定性鑒別熒光物質(zhì)；②為熒光發(fā)射光譜選擇最適宜激發(fā)波長(zhǎng).24十二月202353-16Emissionspectrum熒光光譜fluorescencespectrum固定激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，記錄發(fā)射熒光的強(qiáng)度F與熒光波長(zhǎng)λem的關(guān)系曲線，即為熒光光譜。主要用途：定性定量2、熒光發(fā)射光譜24十二月202353-17熒光波長(zhǎng)發(fā)生Stokes位移：在溶液熒光光譜中，熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光波長(zhǎng).（振動(dòng)弛豫等失活所致）形狀：只有一個(gè)發(fā)射帶，與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。

（因均為一定激發(fā)光下S1*→基態(tài)回遷）與激發(fā)光譜鏡像對(duì)稱因激發(fā)熒光的能級(jí)躍遷與發(fā)射熒光的能級(jí)回遷其能級(jí)分布狀態(tài)和躍遷概率相似，僅能量不同而已。3、發(fā)射光譜的特征24十二月202353-18

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(MAX)固定

ex=290nm(MAX)

em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→31

→21

→1激發(fā)光譜發(fā)射光譜與發(fā)射光譜相同條件下的磷光光譜24十二月202353-202.三維熒光光譜IF

∝f(λex

、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描激發(fā)波長(zhǎng)24十二月202353-21IF

∝f(λex

、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng)24十二月202353-22二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率1、熒光壽命去除激發(fā)光源后，分子熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間，τf.熒光壽命由指數(shù)衰減定律求出：以lnF0/Ft對(duì)t作圖，直線斜率即為1/τf24十二月202353-23τf

與吸光系數(shù)的關(guān)系為：

τf≈10－5/εmax

（s）εmax

為103～105；τf為10－8～10－10秒熒光壽命的特征性與實(shí)際意義：甄別不同熒光組分，可進(jìn)行熒光物質(zhì)的混合物分析.24十二月202353-24

f=0～1。與去活化各種過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)：凡使發(fā)射熒光的速率常數(shù)kF

增加、使其它去活化速率常數(shù)ki降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。kF通常由分子結(jié)構(gòu)決定，而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。24十二月202353-25（二）有機(jī)物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系分子必須具有吸收一定頻率紫外光的特定結(jié)構(gòu)；物質(zhì)吸收特征頻率的輻射后，必須具有較高的熒光效率。1、產(chǎn)生熒光的條件24十二月202353-262、分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響（1）長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)：共軛度越大，熒光效率越大，熒光越強(qiáng)，熒光光譜紅移。（與UV光譜規(guī)律類(lèi)似）24十二月202353-27分子剛性（Rigidity）和平面性越大，分子振動(dòng)越少，系間跨越和碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高，熒光光譜紅移。

（2）剛性平面結(jié)構(gòu)：24十二月202353-28分析并解釋下列事實(shí)：1-二甲胺基萘-4-磺酸鹽

f0.481-二甲胺基萘-5-磺酸鹽

f

0.531-二甲胺基萘-7-磺酸鹽

f0.751-二甲胺基萘-8-磺酸鹽

f

0.0324十二月202353-29

給電子基增強(qiáng)熒光：p–π共軛，如—OH、—OR、—NH2、—CN、—NR2等；化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對(duì)熒光強(qiáng)度1018202020（3）苯環(huán)上的取代基：24十二月202353-30吸電子取代基：減弱熒光不產(chǎn)生p-π共軛，降低共軛?！狢OOH、—C=O、—NO2、—NO、—X等；鹵素X取代基隨原子序數(shù)增加熒光漸弱、磷光漸強(qiáng)，該現(xiàn)象稱重原子效應(yīng)。與π鍵作用較小的取代基：影響不明顯—SO3H、—NH3+無(wú)熒光弱熒光24十二月202353-31指與弱熒光物質(zhì)作用得到強(qiáng)熒光物質(zhì)的化合物。常用熒光試劑：熒光胺：用于脂肪或芳香伯胺鄰苯二甲醛：用于伯胺、氨基酸丹酰氯：伯、仲胺，酚基生物堿測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑：與無(wú)機(jī)離子形成共軛結(jié)構(gòu)的熒光配合物（三）熒光試劑24十二月202353-32三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、溫度：影響顯著溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加，粘度或“剛性”降低）。2、溶劑：形狀、強(qiáng)度均有差別

①一般，極性增大，熒光強(qiáng)度增加并紅移②溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度減弱。（溫度與此也有關(guān)）③因溶劑而形成氫鍵、電離等作用而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)使熒光波長(zhǎng)和強(qiáng)度改變。24十二月202353-33在不同pH值時(shí)，具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化；無(wú)機(jī)熒光物質(zhì)，影響其穩(wěn)定性。具熒光性的金屬有機(jī)配合物也受pH的影響3、pH值：24十二月202353-34指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。熄滅劑：鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基羧基化合物等。熒光熄滅的形式：碰撞猝滅；轉(zhuǎn)化為無(wú)熒光物質(zhì)；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的熄滅，引入溴、碘、氧；電子轉(zhuǎn)移猝滅；濃度較大產(chǎn)生自熄滅。熒光熄滅法:

利用加入熄滅劑后，其熒光強(qiáng)度的減少與熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系測(cè)定熒光熄滅劑含量的方法。4、熒光熄滅與熄滅劑24十二月202353-35瑞利光：與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換只改變方向的散射光。拉曼光：與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，既有能量交換又改變方向的散射光。干擾及消除：散射光尤其是比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的拉曼光干擾較大。消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)避開(kāi)拉曼光。常見(jiàn)溶劑拉曼光如表11-25、散射光的影響24十二月202353-37一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系二、定量分析方法三、熒光分析條件的選擇第二節(jié)熒光定量分析方法24十二月202353-38一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系1、熒光的檢測(cè)：檢測(cè)器與激發(fā)光垂直※注意：該公式的近似處理?xiàng)l件Ecl≤0.052、熒光強(qiáng)度和物質(zhì)濃度的關(guān)系：24十二月202353-39熒光分析法比UV分析法更加靈敏熒光分析法在很弱的背景上直接測(cè)定熒光強(qiáng)度，其靈敏度取決于檢測(cè)器的靈敏度，測(cè)定溶液的濃度更??；紫外可見(jiàn)分析法通過(guò)測(cè)定入射光和透過(guò)光的光強(qiáng)比值，濃度很低時(shí)檢測(cè)器很難檢測(cè)到微小的光強(qiáng)差，信號(hào)放大而比值不變，靈敏度仍不能提高。24十二月202353-401、校正曲線法：2、比例關(guān)系法：當(dāng)校正曲線通過(guò)原點(diǎn)時(shí)，可選擇其線性范圍，用比例法進(jìn)行測(cè)定?？瞻撞荒苷{(diào)零：

(Fs–F0)︰

(F

x-F0)=Cs:Cx

求Cx

F0為空白溶液的熒光強(qiáng)度。3、聯(lián)立方程式法:用于多組分混合樣品含量測(cè)定，同UV。二、定量分析方法24十二月202353-41三、熒光分析條件的選擇（1）樣品濃度的選擇稀濃度，10-5μg/ml～100μg/ml吸光度A>0.05時(shí)，將向濃度軸偏離。（2）激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)的選擇若無(wú)散射光干擾，一般選最大激發(fā)波長(zhǎng)為激發(fā)光最大熒光波長(zhǎng)為熒光的測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定的靈敏度最高。Fc24十二月202353-42（3）散射光干擾及消除干擾的消除改變激發(fā)光的波長(zhǎng)；更換溶劑；采用適當(dāng)?shù)膹?fù)合濾光片或調(diào)整狹縫寬度以減弱散射光。Fc24十二月202353-43第三節(jié)熒光分光光度計(jì)和其他熒光技術(shù)1575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes發(fā)現(xiàn)。1852年，SirGeorgeStokes對(duì)熒光產(chǎn)生的機(jī)理作了解釋?zhuān)⑻岢隽恕盁晒狻薄?867年，首次用于分析測(cè)定。1928年，Jette和West制備首臺(tái)光電熒光計(jì)1952年，商品熒光分光光度計(jì)出現(xiàn)。24十二月202353-44一、熒光分光光度計(jì)I0ItF氙燈、高壓汞燈(或激光）200-800nm光電倍增管石英檢測(cè)器與光路相互垂直24十二月202353-45儀器的校正靈敏度校正：1μg/mL硫酸奎寧對(duì)照品溶液。波長(zhǎng)校正：激發(fā)光譜和熒光光譜校正：24十二月202353-46

（1）激發(fā)熒光分析：?jiǎn)紊院?、選擇性好、靈敏度高。

（2）時(shí)間分辨熒光分析：脈沖熒光作為光源，據(jù)不同物質(zhì)熒光壽命不同進(jìn)行分離。（3）同步熒光分析：利用同步熒光峰峰高與物質(zhì)濃度的正比關(guān)系測(cè)定樣品濃度。

（4）膠束增敏熒光分析：用膠束對(duì)熒光物質(zhì)有增容、增敏和增穩(wěn)的作用測(cè)定，提高了熒光分析法的靈敏度和穩(wěn)定性。二、熒光分析新技術(shù)24十二月202353-47三、熒光分析的應(yīng)用1.無(wú)機(jī)化合物在紫外光照射下會(huì)發(fā)生熒光的無(wú)機(jī)化合物很少，主要依賴于有機(jī)試劑形成的螯合物。直接熒光測(cè)定法熒光熄滅法：測(cè)定某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會(huì)與發(fā)熒光的配合物爭(zhēng)奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的強(qiáng)度此該元素的含量。