超聲強化堿法從槐米中提取蘆丁的工藝研究

PAGE13畢業(yè)設計(論文)課題名稱超聲強化堿法從槐米中提取蘆丁的工藝研究學生姓名歐陽遵亞學號0840921152系、年級專業(yè)生物與化學工程系08級食品質(zhì)量與安全（食品科學與工程方向）指導教師曾祥燕職稱講師2012

超聲強化堿法從槐米中提取蘆丁的工藝研究摘要本文目的是采用超聲波強化堿法取法，以得出超聲波提取槐米中蘆丁的最佳條件。方法是針對提取PH值、超聲波處理時間、提取功率和料液比等四個因素進行研究，并在單因素的基礎上進行正交實驗，用30%乙醇進行浸取方法處理樣品提取蘆丁，用紫外分光光度法確定蘆丁在波長400-600nm之間的最大吸收波長，并用分光光度法測定蘆丁的含量。結果表明影響槐花中蘆丁提取率的因素大小為：D＞A＞B＞C，最佳工藝組合是料液比1：60、PH=10、t=7min、P=300W，即料液比對蘆丁提取率的影響最大，PH值對蘆丁提取率的影響次之，超聲波處理時間影響小一些，提取功率影響最小，當料液比為1：60時，PH值為10，超聲波處理時間為7min，超聲波工作功率為300W的時候，為最佳提取蘆丁工藝條件。關鍵詞：超聲波；蘆?。换泵?；提取；超聲波細胞粉碎機Abstract：Thepurposeofthispaperistheuseofultrasonicsodaemulated,inordertoarriveattheoptimalconditionsofultrasonicextractionHuaimiRutin.ThemethodistoextractthePHvalue,ultrasonictreatmenttimeandextractionpowerofthreefactorsonthebasisofsinglefactororthogonalexperiment,with30%ethanolleachingapproachtothesampleextractrutin,usingUVspectrophotometrythemethodtodeterminerutininthemaximumabsorptionwavelength400-600nmwavelengthandspectrophotometricdeterminationofrutin.TheresultsshowthattheimpactofSophorajaponicaRutinextractionratefactorssize:PH>Time>power,thebestcombinationpH=12,t=5min,P=500W,thePHvalueofrutinextractionrate,theprocessingtimeofimpact,followedbyultrasonicextractionpowerwithminimalimpact,whenthePHvalueof12,theultrasonicprocessingtimeisfiveminutes,theultrasonicpowerof500Wwhenbesttoextractrutinprocessconditions.Keywords:ultrasound，rutin，Huaimi，extract，ultrasoniccellpulverizer目錄中文摘要1英文摘要21引言42槐米43蘆丁44超聲波強化堿法提取槐米中蘆丁的意義45實驗方法55.1供試材料、試劑及儀器55.2實驗方法及過程66結果與討論96.1PH對蘆丁提取率的影響96.2超聲波處理時間對蘆丁提取率的影響106.3超聲波處理功率對蘆丁提取率的影響116.4料液比對蘆丁提取率的影響116.5單因素基礎上的正交試驗117結論12參考文獻12致謝141引言槐樹(SophoraiaponicaL.)尤以在槐米(槐花的花蕾)、果實中蘆丁含量最為豐富。中藥槐花為豆科植物槐SophoraiaponicaL.的干燥花及花蕾,夏季花開放或花蕾形成時采收，及時干燥，除去枝、梗及雜質(zhì)。前者習稱“槐花”，后者習稱“槐米”。我國大部分地區(qū)都有生長。四川有著悠久種植槐樹的歷史。丘陵地帶、房前屋后、山坡上都廣泛種植。蘆?。≧utin）是中藥槐花米中起作用的的有效成分，臨床上主要用于治療高血壓及毛細血管出血。因此人們常以槐花米為原料提取蘆丁。本次實驗采用的是超聲波強化堿法，方法是在單因素水平基礎上進行正交試驗提取槐花中的蘆??；比較不同條件下蘆丁的提取率，確定槐花中蘆丁用超聲波強化提取的最佳條件，為槐花中蘆丁的進一步分離提純提供一定的理論依據(jù)，也為深入開發(fā)和利用槐米提供理論依據(jù)。2槐米槐米廣義是為豆科植物槐（SophorajaponicaL.）的干燥花蕾及花。中國各地區(qū)產(chǎn)，以黃土高原和華北平原為多。夏季花未開放時采收其花蕾，稱為“槐米”；花開放時采收，稱為“槐花”。采收后除去花序的枝、梗及雜質(zhì)，及時干燥，生用、炒用或炒炭用。3蘆丁蘆丁，又名蕓香苷，廣泛存在于槐花、桑葉、水芹、銀杏葉、苦蕎麥、小薊、紅松松針、新疆雪蓮等大多藥用植物中[1-5]，具有抗心肌缺氧、缺血、抗心律失常、降低血清膽固醇、抑制血小板集聚、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、抗炎、抗過敏、抗衰老、抗輻射、抗病毒和增強免疫力等功能，是治療缺血性心臟病、心絞痛、慢性心功能不全、高血脂和預防動脈硬化、心機梗塞、腦血栓等疾病的天然綠色藥物[4]。蘆丁屬于黃酮類化合物[8]，從槐米中提取而來，即具有維生素P一樣的作用及抗菌抗炎和抗輻射作用，又有調(diào)節(jié)毛細血管壁的滲透作用，能降低血管的脆性，有防止血管破裂和止血作用，并對紫外線具有極強的吸收作用，而且具有很好的抗氧化作用，是一種非常好的保健食品原料[9]?，F(xiàn)在關于蘆丁在護膚品中的使用研究越來越多，工藝制作已經(jīng)相當成熟。利用蘆丁的還原性將提取液添加在特制的雪花膏膏體內(nèi)，制成了皮膚保健化妝品，經(jīng)試驗證明，人體涂抹后，強光下可免受紫外線輻射帶來的危害，對日曬紅斑、日曬性皮炎及多種色斑狀均有明顯的保健治療作用[10]。臨床上蘆丁主要用于高血壓病的輔助治療和用于防治因蘆丁缺乏所致的其他出血癥，如防治腦出血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜、急性出血性腎炎、慢性氣管炎、血液滲透壓不正常等癥，同時還用于預防和治療糖尿病及合并高血脂癥[11]。國內(nèi)外醫(yī)藥工業(yè)中用蘆丁作原料生產(chǎn)蘆丁片、維腦路通(羥乙蘆丁)、蘆丁鎂鉻鹽、多維葡萄糖羥丁蘆丁、槲皮素等心血管藥物[12]。特別是羥乙基蘆丁片(曲克蘆丁、維腦路通)[13]，因其由梁克軍[14]等用氯乙醇-醇介質(zhì)法首先制得,并通過藥品鑒定并投料生產(chǎn)。羥乙基蘆丁的制備不僅增大了蘆丁的溶解度,而且擴大了其藥理作用和臨床應用范圍[15]，從而擴大了蘆丁的需求量。蘆丁及其衍生物具有廣泛的藥理活性[17-18]，馬伯良將蘆丁與阿斯匹林和硫酸鎂制成蘆丁復合物,藥理實驗表明其可減輕缺血性腦損傷等[19,20]。蘆丁和金屬離子可以形成穩(wěn)定的配合物，具有抗菌、抗腫瘤活性，配合物與DNA的作用可以改變DNA的復制，從而阻礙腫瘤分子的增長[16]。故近年來蘆丁金屬配合物的研究是藥學研究中的一個熱點[21]。4超聲波強化堿法提取槐米中蘆丁的意義目前多采用堿提酸沉工藝進行提取，但該工藝提取周期需時較長，而且提取率不理想。有機溶劑提取率高，但由于有機溶劑的不安全性質(zhì)，故不易利用。水提和堿提酸沉產(chǎn)率不盡人意。然而超臨界流體的提取有著特殊的溶解能力，可設備是昂貴和應用范圍是狹窄的，所以有必要進行研究。近年來，超聲波輔助提取廣泛應用于有機污染物、天然化合物及生物活性成分的提取，具有許多優(yōu)點，可以取代目前既耗能源、時間，又造成環(huán)境污染，又無法進行有效提取的技術，是一項“可持續(xù)發(fā)展”的“綠色技術”，具有良好的發(fā)展前景和巨大的應用潛力[6-7]。本次實驗用的是超聲波強化堿法，綜合利用超聲波和堿提取。方法是考察單因素水平基礎上進行正交設計提取槐米中蘆??；比較不同條件下提取的蘆丁含量，確定槐米中蘆丁用超聲波強化堿法提取的最佳條件，為槐米花中蘆丁的進一步分離提純提供一定的理論依據(jù)，也為深入開發(fā)和利用槐米提供理論依據(jù)。5試驗方法5.1供試材料、試劑及儀器5.1.1槐米：在邵陽市紅旗路中心大藥房購買。蘆丁標準品：中國藥品生物制品檢定所，使用前不需要干燥處理，按C27H30O16計算，供UV法測定，本品含量為92.5%。5.1.2NaOH：分析純，長沙分路口塑料化工廠無水乙醇：分析純，湖南江虹試劑有限公司NaNO2：分析純，長沙市國營延風化學試劑廠Al(NO3)3:分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司5.1.3WFZUV-4802H紫外可見分光光度計、7200分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、恒溫箱、電子天平、容量瓶、試管、刻度試管、量筒、錐形瓶、玻璃棒、濾紙、燒杯等5.2實驗方法及過程5.2.1超聲波細胞粉碎機是一種利用強超聲在液體中產(chǎn)生空化效應，對物質(zhì)進行超聲處理的多功能、多用途的儀器，能用于動植物組織、細胞、細菌、芽胞菌種的破碎，同時可用來乳化、分離、分散、勻化、提取、脫氣、清洗及加速化學反應等等。本實驗所用儀器由超聲波發(fā)生器和超聲波換能器組件兩大部分組成。超聲波發(fā)生器（電源）是將220VAC、50HZ的單相電通過變頻器件變?yōu)?0-25Hz、約600V的交變電能,并以適當?shù)淖杩古c功率匹配來推動換能器工作，作縱向機械振動，振動波通過浸入在樣品溶液中的鈦合金變幅桿對被破碎的各類細胞產(chǎn)生空化效應，從而達到破碎細胞之目的。5.2.2取槐米50g，置恒溫箱30~40℃干燥24h后粉碎，槐米粉碎后，取過40~80目篩的槐米粉作為樣品。5.2.3超聲波強化堿法提取槐米中槐米粉碎稱取2g置于錐形瓶配置對應PH的溶液加入對應的體積（料液比）用超聲波處理（保護溫度設為40℃，時間和功率根據(jù)實驗方案設定）過濾得到樣液吸取1ml顯色并測定吸光度5.2.4分光光度法是鑒定黃酮類化合物結構的一種重要技術[16]，作為黃酮類物質(zhì)中的一種，此方法對蘆丁也適用，本文采用分光光度法測定槐花中的蘆丁[]。根據(jù)我系實驗室的情況，本文首先是使用WFZUV-4802H紫外可見分光光度計確定蘆丁在400-600nm處的最大吸收波長，然后使用7200分光光度計在最大波長處測定蘆丁的吸光度（因為WFZUV-4802H紫外可見分光光度計不能經(jīng)常給我們學生使用，所以在做論文的時候不能統(tǒng)一時間，經(jīng)與實驗室老師商量，吸光度測定改用7200分光光度計）。（1）蘆丁標準曲線的制作①標準溶液的制備準確稱取蘆丁標準品0.0100g，用30%乙醇水浴微熱溶解，并完全轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用30%乙醇定容②測定波長的選擇量取蘆丁標準液1.00mL，置10mL刻度試管中，加30%乙醇至5mL，加5%NaNO20.30mL，搖勻后放置5min，加10%Al(NO3)30.30mL，搖勻后放置6min,加4%NaOH2.00mL，再用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻后放置10mL，置1cm比色皿中在波長400-600nm之間，測定吸收譜,確定最大吸收波長為500nm，WFZUV-4802H紫外可見分光光度計掃描得下圖，可知在波長400-600nm之間，其峰值在500nm處。圖5.1蘆丁標準樣波長掃描圖③標準曲線制備精密吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL上述蘆丁標準溶液，分別置于6支10mL刻度試管中，按②項下的方法，自“加30%乙醇至5mL”起，同法操作，于500nm測定吸光度（30%乙醇作測定空白），并記錄數(shù)據(jù)。④數(shù)據(jù)處理實際稱取的蘆丁標準品為0.0131g，而標準品供UV法測定，含量為92.5%，所以經(jīng)過換算后，將其對應的質(zhì)量濃度填入下表，單位是mg/ml。表5.3蘆丁標準液濃度-吸光度值蘆丁標準液體積（ml）蘆丁標準液濃度（mg/ml）吸光度00010.0242350.29320.0484700.58630.0727050.82040.0969401.04150.1211751.379用MicrosoftExcel工作表處理，得蘆丁標準液濃度C與吸光度A的關系曲線的回歸方程。圖5.2蘆丁標準曲線（2）蘆丁樣品溶液制備與測定①樣品溶液的制備取槐米樣品2g置于②蘆丁吸光度的測定取4支10mL刻度試管并編號，將①中的樣液精密吸取1.00mL分別置于3支10mL刻度試管中，另一支加入1.00mL30%乙醇作測定空白，加30%乙醇至5mL，加5%NaNO20.30mL，搖勻后放置5min，加10%Al(NO3)30.30mL，搖勻后放置6min,加4%NaOH2.00mL，再用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻后放置10min，置1cm比色皿中測定500nm處的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。③計算公式得到蘆丁的標準曲線后，可以推導出蘆丁提取率的計算公式：首先可以得到蘆丁的質(zhì)量濃度C（mg/ml）與吸光度A的關系：·······················································（5.1）而蘆丁提取率Y與蘆丁的質(zhì)量濃度C的關系為（即蘆丁提取率的計算公式）：··························（5.2）式中：Y為提取率，即蘆丁在樣品中的含量百分比；C為蘆丁的質(zhì)量濃度，單位為mg/ml；D為顯色處理時稀釋倍數(shù)，為10，由比色皿最大刻度（10ml）除以吸取樣液體積（1ml）得到；V為處理槐米樣品時的液體體積，單位為ml（有料液比有關，比如料液比為1:40，則V=80ml如果料液比為1:50，則V=100ml）；M為槐米樣品的質(zhì)量，單位為g。綜合公式5.1和公式5.2，可得蘆丁提取率簡化公式：································（5.3）由于為簡化公式，所以式中字母不帶單位，僅表示數(shù)據(jù)。6結果與討論6.1超聲波處理時間對蘆丁提取率的影響為了探討超聲波處理時間對蘆丁提取率的影響，在其他參數(shù)相同的條件下，即將超聲波粉碎機的保護溫度設為40℃，提取PH為9，功率400W，料液比1:50分別在提取時間為3、5、7、9、11min下提取蘆丁，所得蘆丁提取率與處理時間之間的關系如表6.2所時間（min）吸光度（平均）蘆丁提取率（%）31.2755.5851.4366.3971.5637.0291.2895.57111.3495.75表6.1超聲波處理時間對蘆丁提取率的影響由表6.1可知，開始，隨著超聲波處理時間的增長，蘆丁的提取率也增加，到7min時出現(xiàn)最大值，之后蘆丁的提取率便降的很快，到11min時雖說有點回升，但回升不是很明顯。之所以跌得很快，應該是處理時間過長造成大量的細胞被完全破壞，使細胞中其他物質(zhì)大量的被溶解。6.2超聲波處理功率對蘆丁提取率的影響為了探討超聲波處理功率對蘆丁提取率的影響，在其他參數(shù)相同的條件下，即將超聲波粉碎機的保護溫度設為40℃，提取時間為7min，提取PH為9，分別在提取功率為200、300、400、500、600W下提取蘆丁，所得蘆丁提取率與處理功率之間的關系如表6.2所功率（W）吸光度（平均）蘆丁提取率（%）2001.4436.393001.5226.804001.5737.055001.4026.036001.1575.12表6.2超聲波處理功率對蘆丁提取率的影響由表6.2可知，蘆丁的提取率隨著功率的上升而平穩(wěn)上升，到400W時達到最大值，之后便下降，到500W后，下降的很快，可能是因為功率過大導致其他物質(zhì)的溶解量增大，對蘆丁的提取率受到干擾。6.3PH對蘆丁提取率的影響為了探討PH對蘆丁提取率的影響，利用氫氧化鈉改變?nèi)芤旱腜H值，在其他參數(shù)相同的條件下，即將超聲波粉碎機的保護溫度設為40℃，提取時間為7min，功率400W，分別在提取PH為8、9、10、11、12下提取蘆丁，所得蘆丁提取率與PH之間的關系如表6.3所PH吸光度（平均）蘆丁得率（%）81.3215.8191.5817.03101.6617.47111.3165.63121.1054.93表6.3PH對蘆丁提取率的影響由表6.3可知，隨著PH值的增大，槐米中蘆丁的提取率也逐漸增大，當PH為10時，其提取率最大，之后跌落明顯，可能是因為PH值過大，對蘆丁的性質(zhì)和結構有影響。6.4料液比對蘆丁提取率的影響為了探討料液比對蘆丁提取率的影響，在其他參數(shù)相同的條件下，即將超聲波粉碎機的保護溫度設為40℃，提取時間為7min，功率400W，PH值為10，分別在料液比為1:30、1:40、1:50、1:60、1:70下提取蘆丁，所得蘆丁提取率與料液比之間的關系如表6.4所料液比吸光度（平均）蘆丁得率（%）1:301.5084.031:401.5235.481:501.6747.451:601.6408.741:701.1537.06表6.4PH對蘆丁提取率的影響由表6.4可知，料液比的增加對蘆丁提取率有明顯的影響，料液比達到1:60時蘆丁提取率達到最大值。6.5單因素基礎上的正交試驗根據(jù)單因素試驗所得出的結果，在這基礎上設計正交試驗，其結果如表6.5、表6.6。表6.5因素水平表水平（A）提取PH(B)時間/min(C)提取功率/W(D)料液比1832001:402953001:5031074001:6041195001:70表6.6正交實驗結果編號PH時間/min功率/W料液比樣品質(zhì)量吸光度得率%1832001：402.06680.6192.112853001：501.94220.9034.133874001：602.08081.2526.454895001：702.05160.8154.935933001：602.10171.2966.616952001：702.02940.9866.057975001：401.98591.3544.878994001：502.13921.3465.6291034001：701.93970.9826.30101055001：601.97211.4718.01111072001：501.95371.5287.00121093001：402.10621.7465.94131135001：502.02750.8213.59141154001：401.99230.9343.33151173001：702.05810.8925.39161192001：602.04451.1516.02K117.610718.609321.180916.2585K223.154721.516922.066820.3384K327.252323.705321.703227.0844K418.330922.517021.397622.6673k15.87026.20317.06035.4195k27.71827.17237.35566.7795k39.08417.90187.23449.0281k46.11037.50577.13257.5558R21.382017.502215.006621.6649由正交實驗結果可知，極差R：D＞A＞B＞C，也就是說影響因素的主次為：料液比＞PH＞處理時間＞處理功率。由表中可知，其最優(yōu)方案為：D3A3B2C3，即料液比為1：60，PH為10、處理時間為7min、處理功率為300W時，是提取槐米中蘆丁的最佳條件。7結論本文主要對超聲波強化堿法提取法提取槐花中總黃酮蘆丁進行了初步研究，由重現(xiàn)性實驗的結果可以看出，本文建立的提取方法和測定方法可靠，準確，簡便。本法操作便，結果可靠，重復性好，穩(wěn)定性好，可廣泛用于各種中草藥中黃酮類物質(zhì)含量的測定。參考文獻：［1］曾祥群.葛根總黃酮提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2000,3:33.［2］陳運中.苦蕎麥黃酮含量的測定[J].食品科學,1998,3:54.［3］畢麗君.水芹中總黃酮類化合物最佳提取工藝研究[J].食品科學,1999,12:35.［4］國家藥典委員會.中國藥典[M].北京:化學工業(yè)出版社,2000:789.［5］韓公羽,沈企華.植物藥有效成分的研究與開發(fā)[M].杭州:杭州大學社,1991:576.［6］潘學軍.微波輔助提取(MAE)研究進展[J].化學通報,1999(5):7-13.［7］元英進.中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)關鍵技術[J].北京:化學工業(yè)出版社,2002,114-118.［8］陳友梅主編.中藥化學.濟南:山東科學技術出版社,1988.117.［9］龔盛昭，何遠倫，楊卓如.微波提取蘆丁的協(xié)同效應研究[J].食品科學，2004,25（5）：135-148.［10］陳松林,魏秀莉,苦蕎蘆丁的提取及其在護膚品的應用[J],日用化學工業(yè),1995年,第02期.［11］趙文彬,許玉華,王魯石,等.蘆丁的純化及其含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2007(4):876-878.［12］楊娟,冷曉蓮,鄧靜,等.蘆丁與胰α-淀粉酶的作用研究[J].化學研究與應用,2006,18(7):874-877.［13］賈冬英,耿墨,姚開.苦蕎麥莖及籽殼中黃酮類化合物(蘆丁)的提取及其鑒定[J].食品科學,1998,19(9):46-47.［14］梁克軍.半合成黃酮化合物[J]1醫(yī)藥工業(yè),1977,829:685［15］葉紅,丁福1維腦路通[J]1內(nèi)蒙古藥學,1985,4(2):45［16］蘇碧泉,蘆丁金屬配合物與DNA相互作用研究[D].西北師范大學,中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫(碩士),2007.［17］劉詩平,陳尚猛,朱衛(wèi)東。槲皮素及其衍生物活性的研究進展[J]。中草藥,1991,22(4):182［18］陳勇,張晴1五羥基黃酮的藥理學研究近況[J]。中草藥,1998,29(8):569［19］馬伯良,齊力,羅云萍1蘆丁復合物對兔實驗性腦梗塞血漿中TXB2、62Keto2PGFla的影響[J].華西藥學雜志,1996,11(2):72［20］馬柏良,裴穎,周志剛