血友病的分子發(fā)病機制及治療

血友病的分子發(fā)病機制及治療

血友病是一種遺傳陰性疾病，可分為x性聯(lián)隱性遺傳。分為血友病a（血友病a）和血友病b（血友病b），均為凝血因子（f））引起的。患者主要表現(xiàn)為自發(fā)性關節(jié)、肌肉反復出血,嚴重可因中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血致死。由于目前尚缺乏對此病的根治措施,因此,開展血友病攜帶者的產(chǎn)前診斷、阻止血友病患兒及血友病攜帶者的出生是當前防治該病最有效的措施。f8基因與f9基因的結構及發(fā)育特征FⅧ和FⅨ分別由F8和F9基因編碼合成,2個基因均位于X染色體,前者位于長臂末端Xq28,后者位于Xq27,兩者間的距離為35厘摩(cM)。F8基因全長186kb,由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成。F8mRNA長約9kb,編碼了2351個氨基酸的多肽鏈,其中包含了1條由19個氨基酸組成的信號肽,而成熟蛋白由2332個氨基酸組成。FⅧ蛋白結構為A1-A2-B-A3-C1-C2,分泌至血漿前,FⅧ的B-A3連接區(qū)域及一系列的B結構域在細胞內(nèi)經(jīng)裂解加工成由金屬離子連接的異二聚體,其中重鏈由A1(1~372個氨基酸)-A2(373~740個氨基酸)-B(741~1648個氨基酸)構成,而輕鏈包含A3(1690~2019個氨基酸)-C1(2020~2172個氨基酸)-C2(2173~2332個氨基酸)。血漿中,FⅧ與血管性血友病因子(vonWillebrandfactor,vWF)以非共價鍵結合成復合物的形式存在,vWF可對FⅧ起保護作用。F8基因不僅結構龐大,而且導致血友病A的基因突變種類繁多,其中最常見的是由F8基因內(nèi)含子22倒位突變引起的FⅧ的嚴重缺乏,是45%~50%重型血友病A的分子發(fā)病機制;而F8基因內(nèi)含子1倒位是另一熱點突變,2%~5%的重型血友病A是由該突變所致。對血友病A而言,幾乎每個家系都有不同的突變,存在著高度異質性,包括基因缺失、插入和點突變,如錯義突變、無義突變、剪接突變等,其中65%是由單核苷酸突變引起。F9基因較F8基因小且結構簡單,全長僅34kb,由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成。F9mRNA長2803bp,編碼了461個氨基酸的多肽鏈,其中包含了1條由27個氨基酸組成的介導蛋白分泌的信號肽及1條由19個氨基酸組成的提供維生素K依賴的羧基酶結合位點的前肽,而成熟蛋白由415個氨基酸組成。導致血友病B的基因缺陷類型十分繁多,且無明顯突變熱點。血友病家系中相關女性的致病性基因攜帶隨著分子生物學技術的發(fā)展,基因診斷不僅可以了解導致血友病的本質所在,闡明疾病的發(fā)病機制;其另一重要用途是可以利用所了解的基因缺陷的本質,進行血友病家系中相關女性的致病基因攜帶者診斷。對確診為攜帶者的女性,在其妊娠早期進行產(chǎn)前診斷,避免患兒及攜帶者的出生。因此,這項工作對優(yōu)生、優(yōu)育,提高人口素質有著深遠的意義。根據(jù)所采用方法的不同,基因診斷可分為直接基因診斷和間接基因診斷,前者主要是檢測直接導致疾病發(fā)生的基因缺陷,后者則是利用有缺陷的基因內(nèi)或其旁與其緊密連鎖的多態(tài)性位點為標記,進行家系的遺傳連鎖分析。一、直接診斷1.f8基因斷裂F8基因內(nèi)含子22倒位是45%~50%重型血友病A患者的致病突變。F8基因內(nèi)含子22倒位是該基因第22內(nèi)含子內(nèi)的Int22h-1序列與基因外的2個與之高度同源的序列(Int22h-2、Int22h-3)之一發(fā)生染色體內(nèi)的同源重組,導致F8基因在外顯子1~22與外顯子23~26間發(fā)生斷裂,不能合成正常的FⅧ,導致重型血友病A。F8基因內(nèi)含子22倒位的檢測方法包括Southern印跡法(Southernblot)、長鏈PCR(long-distancepolymerasechainreaction,LD-PCR)、反向PCR(inversepolymerasechainreaction,I-PCR)、改良后的LD-PCR。目前比較常用的為LD-PCR。F8基因內(nèi)含子1倒位是繼內(nèi)含子22倒位后,F8基因中的又一熱點突變,發(fā)生率為2%~5%。F8基因內(nèi)含子1倒位的檢測可通過雙步PCR法,分別對Int1h-1與Int1h-2片段擴增進行分析。2.核苷酸直接測序法除了F8基因內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子1倒位2種F8基因的熱點突變,F8基因的突變可發(fā)生在全部序列中,存在高度異質性。至今已報道突變2107種,其中錯義突變983種,無義突變208種,剪接位點突變158種,小缺失突變357種,大缺失突變255種,插入突變146種。許多實驗室采取核苷酸直接測序法確定家系中先證者F8基因的突變,然后根據(jù)突變進行家系女性成員的攜帶者檢測及產(chǎn)前診斷。直接核苷酸測序法是檢測突變的“金標準”,當發(fā)現(xiàn)一個新的堿基改變時,必須明確該突變是導致血友病A的唯一致病突變,F8基因的編碼序列及其側翼序列需全部檢測。一般終止、缺失、插入突變是致病突變,而無義突變及其他突變可能不是。雖然直接測序有非常高的敏感性,但是依然可能存在某些患者的突變不在測序區(qū)域內(nèi)。據(jù)報道,目前DNA測序法可在98%的患者中發(fā)現(xiàn)突變所在,但還有很少一部分患者可能不是由F8基因突變導致的血友病A。3.f8基因發(fā)揮著間診斷的意義F8基因大片段缺失約占重型血友病A患者的3%~5%,而大片段重復約占血友病A患者的0.6%~0.7%。F8基因大片段缺失的男性患者可以通過相應外顯子電泳條帶的缺失推測出來,但是在大片段缺失的女性攜帶者,由于另一條正常X染色體的存在,各外顯子的電泳條帶均正常而無法診斷。F8基因大片段重復患者和女性攜帶者測序及PCR電泳條帶均正常而無法做出診斷。目前已有多種檢測拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,CNVs)的技術方法,如實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)、液相色譜多重PCR(liquidchromatography-quantitativemultiplexPCR)、多重連接依賴的探針擴增技術(multiplexligation-dependentprobeamplification)、AccuCopy多重熒光競爭PCR法等為CNVs男性患者及女性攜帶者的診斷提供了大大的便利。4.外周血f8基因mrna的基對于經(jīng)典剪切位點突變,即發(fā)生在“GU-AG”4個堿基間的突變,剪切位點分析軟件通常能得出正確的結論。但對于那些位于離剪切位點有一定距離(-60bp)的突變以及突變是否導致新的剪切位點產(chǎn)生,軟件預測結果的可靠性則有待驗證。因此需對患者進行外周血F8基因mRNA異位轉錄水平的分析,以此來評估剪接位點突變的影響。另外,在無法得到先證者cDNA標本時,對剪切位點突變致病機制的研究可以采用小基因體外表達的方式。由于F9基因較小,可以進行直接核酸測序法發(fā)現(xiàn)基因突變。F9CNVs的檢測可以使用AccuCopy多重熒光競爭PCR法、實時熒光定量PCR、多重連接依賴的探針擴增技術等方法。二、多重熒光pcr法多態(tài)性遺傳檢測對于血友病A,由于F8基因不僅龐大而且結構復雜,直接查找突變費時費力,故現(xiàn)在很多國家、地區(qū)都采用間接基因診斷的方法進行血友病A的攜帶者和產(chǎn)前診斷。間接基因診斷可適用的情況包括:①當某家系遺傳的致病基因突變未找到、且以前做過多態(tài)性位點的連鎖分析;②當基因的致病突變不能確定;③當家系的突變是由于基因大部分缺失導致時。對于散發(fā)的血友病A家系,連鎖分析僅能在女性成員的多態(tài)性位點不同于先證者時可以排除其為攜帶者的診斷。間接診斷可用位點:①限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP),主要包括外顯子18外側的BclⅠ,由于信息量有限,僅在其他位點無法得到足夠信息時使用。②可變數(shù)目的串聯(lián)重復(VNTR),DXS52(ST14)是位于F8基因外與F8基因緊密連鎖的VNTR。目前可用PCR方法檢測不同長度片段的復等位基因,因其呈高度多態(tài)性,因此可以用于產(chǎn)前診斷及攜帶者的診斷。③短重復順序(STR),F8基因內(nèi)有3個STR,分別位于內(nèi)含子13、內(nèi)含子22及內(nèi)含子25中,可利用PCR的方法聯(lián)合對這3個多態(tài)標志進行檢測。間接診斷的方法必須有先證者的DNA,患者的母親必須是該分析位點的雜合子。我院近年開發(fā)了用于血友病A基因診斷的F8基因內(nèi)外的新STR位點,獲到滿意效果。多重熒光PCR法進行多態(tài)性遺傳連鎖分析:包括4個距F8基因1.5Mb內(nèi)的STR位點(F8Up226、F8Up146、F8Down48、DXS1073)和2個F8基因內(nèi)的STR位點(F8Int13、F8Int25)。產(chǎn)前診斷加用的性別位點為牙釉蛋白基因(amelogeningene,Amelo)。在血友病B攜帶者和產(chǎn)前基因診斷時,西方人群高信息量的位點(MseI、BamHⅠ、XmnⅠ、TaqⅠ、MnlⅠ、HhaⅠ)在不同種族人群中的雜合度有所不同,在中國漢族人群中的雜合度均較低。我們探索了FⅣ基因外的6個多態(tài)位點(DXS8094、DXS1211、DXS1192、DXS102、DXS8013、DXS1227),采用多重PCR檢測,一次擴增可以使可累計識別能力達到99.99%。間接診斷存在的問題主要有:①由于間接診斷建立在先證者母親為攜帶者的基礎上,而當缺乏家族史時,由于產(chǎn)生新的突變及嵌合體現(xiàn)象的存在,間接診斷可能是不正確的;②當家系中的先證者去世,不能提供有效依據(jù)的信息時,連鎖分析往往不能進行;③當關鍵的家系女性成員(如先證者母親)在選擇的多態(tài)性位點上表現(xiàn)為純合子時,不能為連鎖分析提供有效信息,給連鎖分析帶來困難;④選擇的多態(tài)性位點可能與基因發(fā)生重組,造成誤診。三、特殊疾病和系統(tǒng)的診斷1.不同部位細胞的嵌合體檢測據(jù)文獻報道,約1/3的血友病A家系為沒有家族史的散發(fā)家系。對于這些家系,目前主要通過直接與間接診斷方法相結合來進行診斷,并需要考慮細胞嵌合現(xiàn)象的存在。據(jù)文獻報道,散發(fā)家系中存在一定比例的細胞嵌合現(xiàn)象,從而影響這些散發(fā)家系相關成員的基因診斷,尤其是對先證者母親進行是否為攜帶者的診斷時,即使未發(fā)現(xiàn)其攜帶有與先證者相同的致病基因,也不能直接診斷其為非血友病A致病基因攜帶者。嵌合體的檢測可以通過:①位點特異的PCR法,該法建立在找到先證者的突變位點,且在點突變的基礎上,根據(jù)突變設計2組引物進行PCR擴增,然后進行分析;②對于內(nèi)含子22倒位嵌合體的檢測可用經(jīng)典的Southern印跡法或新報道的反向PCR法進行。2.x染色體非隨機滅活的患者血友病A一般表現(xiàn)為男性發(fā)病、女性攜帶,在男性中發(fā)病率約為1/5000;而女性發(fā)病非常罕見。女性血友病A患者的主要致病機制為:①FⅧ基因的雙雜合突變;②FⅧ基因的純合突變,通常發(fā)生在近親婚配時;